PD-1-PD-L1路徑對人動脈粥樣硬化免疫調控的研究.pdf

1、動脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）是一種慢性炎癥性疾病，以強烈的免疫活化為特征，T細胞介導的免疫反應在疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。目前已明確，無論是在人體還是小鼠模型，各個發(fā)展階段的動脈粥樣硬化斑塊均存在大量的T淋巴細胞，包括CD4+和CD8+T細胞亞群。目前尚無充足的證據能完全闡明AS病理過程中的免疫調控機制。
　　B7/CD28家族成員相關路徑在調控T細胞相關的刺激性與抑制性信號的平衡方面起關鍵作用

2、，從而對抗微生物感染及實現(xiàn)自身免疫耐受。該類路徑提供第二信號調控T細胞反應的激活、抑制及微調。過去幾年研究發(fā)現(xiàn)，B7/CD28家族有許多能削弱T細胞應答并促進T細胞耐受的抑制性信號通路，其中近年發(fā)現(xiàn)的程序性死亡因子-1（PD-1）及其配體（PD-L）通路由于獨特的抑制功能引人矚目，被認為是影響自身免疫和感染性疾病慢性化的重要因素。PD-1也稱CD279，屬于免疫球蛋白超家族成員，主要與抗原提呈細胞（antigenpresentingce

3、lls，APCs）表面的PD-L1和PD-L2（分別又稱為B7-H1和B7-DC）結合后抑制T細胞免疫反應。干擾素α、β和γ是強有力的PD-L1表達上調因子，可促進PD-L1表達于抗原提呈細胞、內皮細胞和上皮細胞。PD-1具有整合功能，可通過與PD-L的相互作用整合DC的信號，繼而控制T細胞耐受和活化。目前，PD-1/PD-L路徑正逐漸成為重要的T細胞反應調控子，控制慢性感染性疾病及自身免疫疾病的過程。其中，PD-1/PD-L路徑與DC

4、-T細胞相互作用之間的關系更是受到了廣泛關注。作為體內抗原提呈能力最強的APCs，DC在免疫調控方面發(fā)揮著至關重要的作用。相對于PD-L2的作用而言，DC表面的PD-L1更值得關注。最新研究發(fā)現(xiàn)，在PD-L1/2-/-LDLR-/-小鼠模型體內，高膽固醇血癥及其導致的動脈粥樣病變?yōu)橄到y(tǒng)免疫性疾病，受PD-1/PD-L1/2路徑的調節(jié)。這一路徑是否影響了人體內T細胞對高膽固醇血癥或其他相關抗原的反應及相應的動脈病變的進展，目前尚無報道。<

5、br>　　本研究以動脈粥樣硬化患者為研究對象，取外周血單個核細胞（peripheralbloodmononuclearcell，PBMC），分別檢測CD4+、CD8+T淋巴細胞與髓系樹突狀細胞（myeloiddendriticcells，mDCs）表面的PD-1與PD-L1的表達水平，并分析其表達水平的高低與細胞免疫活性之間的關系，如mDCs刺激T細胞增殖的能力和分泌細胞因子的能力等；干擾素體外干涉PD-L1的表達，研究其表達變化對免疫

6、活性的影響，以期闡明PD-1/PD-L1路徑對機體免疫過程的影響及其在動脈粥樣硬化病變過程中所發(fā)揮的作用，從而為AS的免疫調控治療提供新的理論依據。為此，本研究主要完成了以下三方面的工作：
　　1.標本的收集、細胞因子檢測及PBMC表面PD-1/PD-L1的表達特點分析
　　按入選標準篩選我科確診的動脈粥樣硬化病人，肝素抗凝管收集其外周血，并整理相關臨床資料；分離外周血PBMC；ELISA法檢測患者血清中IFN-γ、IL-2

7、、IL-10和IL-12等細胞因子的濃度；利用流式細胞儀檢測入選患者外周血CD4+、CD8+T細胞表面PD-1及PD-L1的表達水平，檢測mDCs表面PD-L1的表達水平，以健康志愿者作對照。
　　2.PD-1/PD-L1路徑對動脈粥樣硬化患者T淋巴細胞免疫功能的影響
　　細胞陽性分離試劑盒分離純化CD4+、CD8+T細胞及mDCs，用患者及健康人的mDCs與非自體健康人的CD4+或CD8+T細胞混合培養(yǎng)，以同種異體淋巴細胞

8、增殖反應為基礎，采用[3H]-TdR摻入法和ELISA法分別檢測細胞的增殖和細胞培養(yǎng)上清中炎癥相關細胞因子的濃度。
　　3.體外刺激PD-L1上調后mDCs功能改變及其對T細胞的影響
　　α干擾素可在體外短期內上調PD-L1在mDCs表面的表達，本研究利用α干擾素作為PD-L1的正性調控因素，通過α干擾素對mDCs的作用，研究上調PD-L1表達對mDCs刺激T細胞增殖能力的影響及細胞因子分泌功能的影響。同樣以異體淋巴細胞增殖

9、反應為基礎，采用[3H]-TdR摻入法和ELISA法檢測細胞的增殖和細胞培養(yǎng)上清中炎癥相關細胞因子的濃度。
　　結果：
　　1.動脈粥樣硬化患者外周血中CD4+、CD8+T細胞表面PD-1的表達百分比下降，CD4+T細胞、mDCs表面PD-L1的表達百分比下降。
　　2.動脈粥樣硬化患者外周血中促炎細胞因子（IFN-γ、IL-2、IL-12）水平明顯增高，而抗炎細胞因子IL-10則明顯降低，且穩(wěn)定性心絞痛組與急性冠脈綜

10、合征組也有明顯差異（可能是急性冠脈綜合征時炎癥反應增強的結果）。
　　3.異體淋巴細胞增殖反應顯示，患者的mDCs刺激異源性CD4+或CD8+T細胞增殖的能力和分泌I型效應細胞因子（IFN-γ、IL-2）的能力比健康人的mDCs明顯升高；細胞培養(yǎng)上清中IL-12的濃度明顯升高，而IL-10的濃度則明顯降低，說明患者mDCs與T細胞之間的相互作用能力較健康人增強。
　　4.α干擾素可以上調mDCs表面PD-L1的表達，造成mD

11、Cs刺激異體CD4+或CD8+T細胞增殖的能力下降，促炎細胞因子分泌水平降低；同時，PD-L1表達的上調使mDCs與T細胞之間的相互作用能力下降，IL-12濃度降低，而IL-10濃度升高。
　　結論：
　　1.程序性死亡因子1及其配體表達水平在動脈粥樣硬化過程中下調，影響了淋巴細胞與mDCs之間的相互作用，使T細胞增殖能力增強，炎性細胞因子分泌水平升高，炎癥過程加劇。
　　2.PD-1/PD-L1路徑可能在動脈粥樣硬化