匹羅卡品致癇大鼠海馬鈣視網膜蛋白、微清蛋白陽性中間神經元的動態(tài)變化及其突觸聯(lián)系.pdf

1、目的:
　　 顳葉癲癇是癲癇中最常見的類型。顳葉癲癇的病因和補償機制較多。其中一種機制是人類和癲癇大鼠模型中海馬主細胞的數(shù)目變化及其軸突出芽。目前大部分關于海馬神經組織的認識都來自于對這些主細胞的研究。最近人們才將研究重點轉移到了顳葉癲癇模型中調節(jié)神經元相互作用的抑制性中間神經元上,已有關于海馬區(qū)域GABA能中間神經元對興奮毒性損害易損性的報道。但對于該區(qū)域不同時間點鈣視網膜蛋白(calretinin,CR)陽性中間神經元的變化

2、,目前還知之甚少。
　　 方法:
　　 本研究在中國湖南省長沙市中南大學湘雅醫(yī)院完成。應用匹羅卡品誘導癲癇持續(xù)狀態(tài)(status epilepticus,SE)制成慢性癲癇大鼠模型。220只大鼠被隨機分成兩組:癲癇大鼠組(n=170):腹腔內注射氯化鋰-匹羅卡品；正常對照大鼠(n=50):腹腔內注射生理鹽水。癲癇大鼠又被隨機分為兩個亞組:預實驗組(n=50):首劑給予匹羅卡品30mg/kg,后每間隔30min反復給予低劑

3、量匹羅卡品10mg/kg；癲癇組(n=120):首劑給予匹羅卡品25mg/kg,后反復給予匹羅卡品10mg/kg,在給予匹羅卡品前24小時腹腔內注射氯化鋰。按照Racine標準,根據大鼠的運動性發(fā)作對每只匹羅卡品致癇大鼠進行評分。對來自不同時間點(SE后2h、6h、1d、3d、7d、15 d、30d和60d)的癲癇大鼠以及相應年齡的對照大鼠腦切片進行免疫組化,以了解癇性發(fā)作后海馬神經元所受的影響。行Nissl染色觀察海馬病理學改變。

4、r>　　 結果:
　　 預實驗組中有60％大鼠致癇成功,10％大鼠死亡,30％未進入癲癇持續(xù)狀態(tài),致癇不成功。癲癇組中死亡率為10％,致癇成功率85％。與正常大鼠相比,癲癇大鼠海馬亞區(qū)存在神經細胞的缺失。本研究結果顯示,SE后7d、30d和60d癲癇大鼠海馬門區(qū)、CA1區(qū)和CA3區(qū)細胞缺失最明顯。對照組與癲癇組之間有明顯統(tǒng)計學差異(P<0.05)。同樣SE后1天的門區(qū)也有明顯的細胞缺失(P<0.05)。定量分析顯示SE后1d、

5、30d和60d癲癇大鼠CR陽性中間神經元數(shù)目與對照大鼠的相比有明顯的統(tǒng)計學差異(P<0.05)。兩組大鼠中這些中間神經元在門區(qū)、CA1區(qū)和CA3區(qū)都有分布,但正常大鼠海馬中中間神經元的數(shù)量更多。SE后7d和15dCA區(qū)域CR陽性中間神經元的一過性增加被觀察到(P>0.05)。癲癇大鼠中CR中間神經元主要分布于門區(qū)和CA1區(qū),正常對照大鼠中CR中間神經元主要分布于門區(qū)。
　　 結論:
　　 本研究結果提示,相比腹腔內注射3

6、0mg/kg匹羅卡品的方法,在氯化鋰預處理后腹腔內注射25mg/kg匹羅卡品更能有效促使大鼠癲癇的發(fā)生。癲癇大鼠海馬CR陽性抑制性中間神經元的數(shù)量與對照大鼠的相比存在明顯差異。CR陽性中間神經元的數(shù)目和分布變化引起的海馬抑制性回路的功能性改變可能在平衡興奮性輸入增強中起補償作用。
　　 目的:
　　 腦區(qū)域由基本的局部回路和細胞群組成,其中任一局部異常都有可能發(fā)展成癲癇?；芈酚钟删哂袇^(qū)域特異性的特殊類型神經元構成。顳葉癲

7、癇是難治性癲癇中最常見的類型,海馬是顳葉癲癇中受影響最大的區(qū)域。顳葉癲癇的臨床特征是在早期的神經損傷后,經過一段潛伏期,再出現(xiàn)難治性的自發(fā)性反復復雜部分性發(fā)作,提示顳葉癲癇患者腦中可能存在著隨著時期變化的一系列異常結構重組。匹羅卡品致癇模型模擬了人類顳葉癲癇的發(fā)展過程,在匹羅卡品誘導癲癇持續(xù)狀態(tài)后最終導致反復的自發(fā)性癇性發(fā)作。目前關于人類顳葉癲癇和大鼠模型中齒狀回顆粒細胞苔蘚纖維出芽引起海馬興奮性回路重組的報道較多,但顳葉癲癇中海馬回路

8、的其它異常構成,特別是顳葉癲癇海馬抑制性回路的重組還不清楚。本研究中,擬利用熒光金(FG)確定顳葉癲癇慢性期大鼠海馬錐體細胞的突觸聯(lián)系,聯(lián)合應用鈣視網膜蛋白(CR)和FG觀察慢性期大鼠海馬CA1區(qū)CR陽性抑制性中間神經元的起源和突觸聯(lián)系。
　　 方法:
　　 大鼠被隨機分為兩組:癲癇大鼠組和正常對照組。癲癇大鼠在腹腔內注射氯化鋰18-24小時后注射匹羅卡品30mg/kg,接著每間隔30min給予10mg/kg匹羅卡品,直

9、至癲癇持續(xù)狀態(tài)的發(fā)生,對照組同時腹腔內注射相應劑量的生理鹽水。根據Racine標準對癲癇大鼠進行評分。致癇后兩月,利用Kopf立體定位儀和漢密爾頓微量注射器將逆行性示蹤劑注射入兩組大鼠海馬特異的靶位。熒光金被微量注射入海馬CA1區(qū)。術畢大鼠回籠喂養(yǎng)5到7天,然后灌注取材,行免疫熒光觀察大鼠海馬中FG標記的細胞以及FG和CR雙標記的中間神經元。
　　 結果:
　　 在氯化鋰-匹羅卡品模型中,55％大鼠致癇成功發(fā)展成SE,2

10、0％大鼠死亡,25％未致癇成功。致癇成功大鼠中又有25％在制作過程中死亡從而被剔除。
　　 本研究首次發(fā)現(xiàn)匹羅卡品致癇大鼠中存在大量FG標記的CA1和CA3錐體細胞,對照大鼠中亦存在大量FG標記的CA1錐體細胞。FG標記的CR陽性中間神經元在兩組中均被觀察到。海馬CA1區(qū)FG標記的CR陽性中間神經元和單標記的CR陽性中間神經元與對組組相比無明顯變化(P>0.05)。FG標記的CR陽性中間神經元在實驗組的CA1、CA3和門區(qū)以及對

11、照組的CA1區(qū)均可被觀察到。
　　 結論;
　　 本研究結果提示,大鼠海馬中存在兩種FG標記的鈣視網膜蛋白陽性中間神經元的聯(lián)系途徑,第一種是癲癇大鼠中CA3至CA1的抑制性突觸聯(lián)系和門區(qū)至CA1的抑制性突觸聯(lián)系,第二種途徑是大鼠中CA1區(qū)之間的抑制性突觸聯(lián)系。癲癇大鼠慢性期存在錐體細胞之間的突觸重組。CR神經元可能部分來源于CA1遠隔區(qū)域CR中間神經元的軸突出芽。
　　 目的:
　　 海馬是顳葉癲癇的重要

12、結構基礎。海馬谷氨酸能介導的興奮性和GABA能介導的抑制性之間的失衡是顳葉癲癇發(fā)生的重要機制之一。表達鈣結合蛋白,特別是表達微清蛋白(PV)的抑制性GABA能亞型,在控制主細胞興奮性中起重要作用。它們分布的位置和數(shù)量的不同可能導致大量神經元的異常同步化和過度放電,從而引起癲癇的發(fā)生。海馬在神經系統(tǒng)中與癲癇相關,且在顳葉癲癇中存在選擇性的細胞變性。本研究中,我們擬觀察持續(xù)狀態(tài)后大鼠不同時間點海馬各亞區(qū)的神經病理學改變。
　　 方法

13、:
　　 100只SD大鼠被隨機分為兩組:癲癇大鼠組,應用氯化鋰-匹羅卡品方案誘導癇性發(fā)作；正常對照組,大鼠腹腔內注射生理鹽水。在給予30mg/kg匹羅卡品前注射氯化鋰。在癲癇持續(xù)狀態(tài)持續(xù)一小時后,腹腔內注射水合氯醛中斷癇性發(fā)作。行尼氏染色和微清蛋白免疫組化觀察氯化鋰-匹羅卡品致癇大鼠海馬亞區(qū)的神經病理學變化。
　　 結果:
　　 癲癇大鼠中,55％大鼠致癇成功,40％死亡,5％未致癇成功。4只發(fā)作頻率低。從注射

14、匹羅卡品至持續(xù)狀態(tài)的發(fā)生平均間隔15min。癲癇持續(xù)狀態(tài)后7天和2月大鼠被觀察。組織學染色顯示CA1和CA3區(qū)錐體細胞層細胞缺失最明顯。相一致的,免疫組化顯示PV陽性神經元和纖維在這些亞區(qū)的變化比門區(qū)的變化更明顯。詳細分析進一步證實PV陽性中間神經元在癲癇早期即表現(xiàn)出形態(tài)學改變。PV神經元的變性主要在始層被觀察到。SE后1天CA1和CA3區(qū)PV神經元數(shù)目減少(P<0.05),并隨著時間的推移越來越少。在SE后2月PV神經元減少最明顯(P

15、<0.01)。與SE后24小時相比,SE后2月PV陽性中間神經元明顯減少(P<0.05)。
　　 結論:
　　 本研究結果提示顳葉癲癇中海馬不同亞區(qū)PV陽性神經元的易損性不同。這可能對顳葉癲癇海馬回路的纖維輸入和輸出有影響。
　　 目的:
　　 匹羅卡品是癲癇模型中被廣泛使用的誘導劑。腹腔內注射匹羅卡品可以模擬人類顳葉癲癇的臨床和神經病理學特征。癲癇持續(xù)狀態(tài)后模型,特別是氯化鋰-匹羅卡品模型的使用,對于了

16、解癲癇的病理生理學機制十分有幫助。先前的急性處理方法制作的癲癇動物模型常死亡率很高,而致癇成功率低。本論文第一部分(相關文章已被neuroscience雜志接收)顯示,減少匹羅卡品的劑量可使死亡率降低,但致癇成功率不能令人滿意。本研究中,我們在匹羅卡品注射前12小時給予氯化鋰,并減少匹羅卡品的注射劑量,以期最大程度地減少死亡率和提高致癇成功率。
　　 方法:
　　 本研究在中國中南大學湘雅醫(yī)院和巴勒斯坦Al Najah大

17、學完成。200只大鼠被隨機分為兩組:組A,給予氯化鋰24小時后首次注射匹羅卡品30mg/kg,后每隔30min注射匹羅卡品10mg/kg；組B,給予氯化鋰12小時后首次注射匹羅卡品20mg/kg,后每隔30min注射匹羅卡品10mg/kg直至誘導SE。SE持續(xù)60分鐘時,腹腔內注射10％水合氯醛(3.5ml/kg)終止發(fā)作。
　　 結果:
　　 組A中,誘導SE所需的平均匹羅卡品劑量為32mg/kg,組B中平均匹羅卡品劑

18、量為22mg/kg。在終止SE時,組A中62％大鼠被誘導SE成功,17％死亡,21％未進行癲癇持續(xù)狀態(tài)；而組B中幾乎100％大鼠被誘導SE成功,死亡率為零,明顯低于組A的死亡率。所有SE持續(xù)60min的大鼠最終均出現(xiàn)慢性自發(fā)發(fā)作。兩組大鼠SE至首次自發(fā)發(fā)作的平均潛伏期均為15-30天。兩組大鼠自發(fā)發(fā)作的頻率和嚴重性無明顯差異。
　　 結論;
　　 本研究結果提示,當縮短氯化鋰預處理的時間間隔和減少匹羅卡品的劑量時,大鼠的