雞柔嫩艾美耳球蟲頂膜抗原AMA1蛋白親和肽篩選及其抗球蟲作用研究.pdf

1、雞球蟲是嚴重危害養(yǎng)禽業(yè)的病原體之一，導致養(yǎng)禽業(yè)經濟損失巨大。盡管飼料添加藥物的方式對球蟲病的防控發(fā)揮了重要的保障作用，但隨著雞球蟲抗藥性、藥物殘留等一系列問題的產生，迫切需要尋找新的藥物靶標分子從而開發(fā)新型藥物。對瘧原蟲和弓形蟲等寄生原蟲的研究已經表明，頂復門原蟲的項膜抗原1(AMA1)是頗具應用前景的藥物靶標。瘧原蟲、弓形蟲等在侵入宿主細胞的過程中，AMA1發(fā)揮重要作用。但目前關于雞柔嫩艾美耳球蟲（E.tenella）子孢子頂膜抗原1

2、（EtAMA1）的功能的相關報道較少。本研究探索了EtAMA1胞外域重組蛋白(EctoAMA1)親和配體在球蟲感染中的抑制作用。
　　1.以純化并復性的原核重組EctoAMA1蛋白為靶蛋白，利用噬菌體十二肽庫對其進行四輪生物淘選。從第四輪洗脫物中隨機選出30個噬菌體藍斑，擴增后提取其核苷酸序列并測序，進而推導出多肽序列。結果顯示:對靶分子進行四輪篩選后，得到5種親和力較高的十二肽。選取高親和力的兩條多肽序列進行合成，命名為L肽和C

3、肽，即為LPSYPGYYQITI(L)和CWTISLFGGVTQ(C)。間接ELISA結果表明，所合成兩多肽與重組Ecto AMA1蛋白及EtAMA1蛋白均能夠特異性結合。競爭ELISA結果表明，抗EctoAMA1重組蛋白多克隆抗體能夠抑制親和噬菌體與重組EctoAMA1的結合。
　　2.對L肽和C肽體外抑制子孢子入侵細胞能力進行評價。首先用MTT法檢測L、C兩多肽對MDBK細胞的最大無毒濃度，確定最大無毒濃度為125μg/mL。

4、使用pecoll梯度離心法純化E.tenella子孢子，得到較為純凈的E.tenella子孢子，用CFDA-SE熒光探針標記純化后的子孢子，利用標記有綠色熒光的子孢子（3×105個/孔）入侵MDBK（鋪板量1×105個/孔）細胞10h，流式細胞儀檢測多肽L、C分別在濃度為25μg/mL、50μg/mL、75μg/mL、100μg/mL、125μg/mL時抑制子孢子入侵的作用。結果表明:L肽及C肽對子孢子入侵MDBK細胞均具有一定的抑制作

5、用。在不同濃度梯度下L肽作用均顯著或極顯著高于C肽(P＜0.05或P＜0.01)。
　　3.對L肽和C肽體內抗球蟲感染作用進行評價。1日齡雛雞40只隨機分為4組，每組10只，分別為PBS組、L肽處理組、C肽處理組以及攻蟲對照組。21日齡時，L組、C組、攻蟲對照組雞每只口服感染1×104個E.tenella卵囊，在感染后0～2天（子孢子繁殖期），L組口服L肽對應陽性噬菌體，每只每天1×1012pfu;C組口服C肽對應噬菌體，每只每天

6、1×1012pfu。攻蟲后第8天剖殺全部雞只，檢測雞增重變化、盲腸病變計分、盲腸眼觀病變及病理組織病變、OPG及ACI等評價指標。結果顯示:L組、C組各項指標均顯著優(yōu)于攻蟲對照組(P＜0.05)，L組與C組相比，L組各項指標均稍優(yōu)于C組。PBS組、L組、C組、攻蟲對照組抗球蟲指數(shù)分別為200、164.45、153.64、119.45。
　　4.應用Swiss-Model軟件對EtAMA1進行三維模建。利用Autodock4.2軟件

7、分別對L肽與EtAMA1、C肽與EtAMA1進行分子對接分析，研究EtAMA1在空間上與L肽和C肽結合方式。結果顯示:同源建模評分達90分以上，模型結果合理可靠。L肽、C肽的氨基酸與EtAMA1活性中心氨基酸間均存在分子間氫鍵作用力與疏水作用力，L、C肽在空間上均能夠與EctoAMA1良好結合。
　　綜上，本實驗結果表明，篩選出的兩個Ecto AMA1重組蛋白親和配體可以與EtAMA1良好結合，能夠抑制E.tenella子孢子入侵