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文檔簡介
1、背景:因?yàn)槿狈ο到y(tǒng)的治療方法,所以在治療晚期胃腺癌中一直沒有多大進(jìn)展,這也主要?dú)w咎于胃腺癌細(xì)胞對化療藥物誘導(dǎo)的凋亡產(chǎn)生抵抗。很多不同種類的化療藥物通過損傷細(xì)胞DNA,導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子P53的激活,然后P53通過上調(diào)促凋亡蛋白例如Puma和Noxa來介導(dǎo)凋亡。臨床上常用的DNA損傷誘導(dǎo)劑依托泊苷是拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ抑制劑,可與DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ相互作用,從而使DNA的單鏈和雙鏈斷裂。但是胃腺癌細(xì)胞對依托泊苷具有不同的敏感性,阻礙了其在臨床上的應(yīng)用。
2、 目的:為了更好的理解依托泊苷誘導(dǎo)胃腺癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制,特別是檢測Bcl-2家族BH3-only蛋白Noxa、Puma和Bim在決定胃腺癌細(xì)胞對依托泊苷誘導(dǎo)凋亡的敏感性中的作用,為臨床治療以及發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)尋找理論依據(jù)。方法:在不同時(shí)點(diǎn)向體外培養(yǎng)的SGC-7901、BGC-823細(xì)胞中加入不同劑量的依托泊苷,MTT法檢測依托泊苷處理后細(xì)胞生存率,確定依托泊苷的實(shí)驗(yàn)劑量;流式細(xì)胞儀AnnexinV/PI雙染法檢測依托泊苷誘導(dǎo)的細(xì)
3、胞凋亡率;流式細(xì)胞儀檢測廣譜caspase抑制劑Z-VAD-fmk對依托泊苷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的抑制率;半定量RT-PCR和Westernblot分別檢測在依托泊苷誘導(dǎo)前后P53、Noxa、Bim、Puma的mRNA和蛋白的表達(dá)水平。 結(jié)果:依托泊苷以劑量、時(shí)間依賴的方式誘導(dǎo)胃腺癌細(xì)胞凋亡,SGC-7901細(xì)胞系比BGC-823更加敏感,100μM的依托泊苷作用48小時(shí)后SGC-7901的凋亡率達(dá)到50%,而BGC-823的凋亡率只有
4、20%。廣譜caspase抑制劑Z-VAD-fmk能有效抑制依托泊苷誘導(dǎo)的胃腺癌細(xì)胞凋亡,抑制率達(dá)50%以上,說明依托泊苷誘導(dǎo)胃腺癌細(xì)胞凋亡在很大程度上依賴caspase。在SGC-7901細(xì)胞系中依托泊苷作用后4小時(shí)就可以觀察到P53和它的轉(zhuǎn)錄目標(biāo)Noxa的mRNA很快的上調(diào),8小時(shí)可觀察到其蛋白質(zhì)有明顯的增高;而在BGC-823細(xì)胞系中依托泊苷作用前后P53和Noxa的mRNA和蛋白質(zhì)水平變化不大。另一個(gè)P53轉(zhuǎn)錄目標(biāo)Puma在SG
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