花椒揮發(fā)油改善心得安所致豚鼠耳部銀屑病樣局部皮膚病變的藥理作用研究.pdf

1、背景:
　　 銀屑病(psoriasis)俗稱“牛皮癬”，是一種常見(jiàn)的皮膚病。因?yàn)樗钠ふ畋憩F(xiàn)為紅色斑疹、丘疹或斑塊，上面覆有多層銀白色的鱗屑，這種特征性的表現(xiàn)是銀屑病病名的來(lái)源，其病理表現(xiàn)為，角質(zhì)形成細(xì)胞增殖過(guò)度伴角化不全，真皮毛細(xì)血管擴(kuò)張，以及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。銀屑病的病因并不完全清楚且頑固難治，被世界衛(wèi)生組織列為十大頑癥之一。銀屑病的發(fā)病機(jī)制近年來(lái)已有了許多新的研究和成果，但是。銀屑病臨床表現(xiàn)復(fù)雜多變，病因尚不完全清楚。就目前

2、的研究情況而言，銀屑病與遺傳、感染、代謝障礙、免疫功能紊亂、內(nèi)分泌失調(diào)有關(guān)。近年來(lái)，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為銀屑病的發(fā)病是一種多基因遺傳多因素作用參與的T細(xì)胞免疫介導(dǎo)性皮膚病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。其中CD4+T淋巴細(xì)胞免疫功能異常在其發(fā)病中尤為重要。CD4+T淋巴細(xì)胞主要分為Th1和Th2兩大亞群。Th1分泌IFN-γ和IL-12等細(xì)胞因子，以分泌IFN-γ為特征;而Th2分泌IL-4、IL-2等細(xì)胞因子，以分泌IL-4為特征，IFN-γ和IL-4分別

3、是Th1和Th2細(xì)胞亞群標(biāo)志性細(xì)胞因子。研究發(fā)現(xiàn)，銀屑病的發(fā)病與Th1/Th2細(xì)胞因子失衡有關(guān)，銀屑病皮損組織中大量聚集CD4+T細(xì)胞，活化的角質(zhì)形成細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子作用于T細(xì)胞，進(jìn)一步促進(jìn)其成熟。T細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子形成細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，致使出現(xiàn)銀屑病的病理?yè)p傷。
　　 就目前抗銀屑病的藥物發(fā)展來(lái)看，傳統(tǒng)的外用藥物起到的治療作用不大，系統(tǒng)療法中的各種口服藥物雖有一定的治療作用，但同時(shí)具有較強(qiáng)的副作用。而生物治療雖是

4、抗銀屑病藥物的發(fā)展方向，但現(xiàn)在用于臨床的藥物較少還不夠成熟且治療成本較高。我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥對(duì)銀屑病的治療也有相當(dāng)長(zhǎng)的歷史，臨床上中藥治療銀屑病除遵循傳統(tǒng)中醫(yī)藥學(xué)辨證施治原則外，可辨證選用中藥或提取中藥的主要有效成分對(duì)銀屑病進(jìn)行治療。
　　 花椒是蕓香科植物花椒Zanthoxylumungeanum的干燥成熟果實(shí)，花椒藥用歷史悠久，《本草綱目》記載其味辛，性溫，有小毒，麻，歸脾、胃、腎經(jīng)，主治風(fēng)邪氣，出寒痹，入肺散寒，入脾除濕，水腫瀉

5、痢。其化學(xué)成分主要有生物堿、酰胺、木脂素、香豆素、揮發(fā)油和脂肪酸等。對(duì)心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、免疫機(jī)能、凝血功能、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗炎、抑菌殺蟲(chóng)、抗腫瘤等均具有較強(qiáng)的藥理活性。民間一直流傳利用花椒治療銀屑病的偏方，其中比較常見(jiàn)的是將花椒置于食用醋中，熬煮30分鐘，過(guò)濾后用溶液外涂銀屑病皮損處;另一種是將花椒置于高度白酒中，浸泡3-5天，過(guò)濾后用溶液外涂銀屑病皮損處。兩種方法均可以一定程度改善皮損紅腫的狀態(tài)，減小皮損面積。食用醋和高度白酒作為溶

6、劑本身不具備治療銀屑病的作用，因此提示我們花椒的主要化學(xué)成分有可能起到改善銀屑病的局部皮膚病變。
　　 隨著對(duì)花椒主要化學(xué)成分尤其是對(duì)花椒揮發(fā)油藥理作用的深入研究，發(fā)現(xiàn)其具有抗腫瘤的作用。臧林泉等人研究發(fā)現(xiàn)高濃度(4～16mg/ml)的花椒揮發(fā)油對(duì)人肺癌A549細(xì)胞株有殺傷作用，低濃度(1mg/ml)的花椒揮發(fā)油對(duì)A549有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。袁太寧等人研究發(fā)現(xiàn)，花椒揮發(fā)油可在體外有效抑制小鼠H22肝癌細(xì)胞、人肺癌A549細(xì)胞周

7、期的正常轉(zhuǎn)換，阻止細(xì)胞的有絲分裂、抑制細(xì)胞生長(zhǎng)并激發(fā)程序性細(xì)胞凋亡。李品艾等人發(fā)現(xiàn)花椒揮發(fā)油具有直接抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖、促進(jìn)其凋亡的作用。國(guó)外研究報(bào)道，花椒揮發(fā)油中富含的異戊二烯萜類物質(zhì)可通過(guò)對(duì)腫瘤細(xì)胞周期的阻滯和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用。異戊二烯萜類中的右旋檸檬烯抗腫瘤活性較強(qiáng)，對(duì)多種腫瘤具有治療作用?；ń窊]發(fā)油確實(shí)可以抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖，并且可以通過(guò)對(duì)腫瘤細(xì)胞周期的阻滯，阻止其正常有絲分裂從而達(dá)到抑制細(xì)胞生長(zhǎng)誘導(dǎo)

8、其凋亡的作用。為花椒揮發(fā)油改善心得安所致豚鼠耳部銀屑病樣局部皮膚病變，提供了可能的理論依據(jù)。為此我們構(gòu)建了豚鼠銀屑病樣病理模型，觀察花椒揮發(fā)油外用的療效，以期為花椒揮發(fā)油治療銀屑病的研究提供最初的依據(jù)。國(guó)內(nèi)迄今未見(jiàn)花椒揮發(fā)油治療銀屑病的相關(guān)實(shí)驗(yàn)或臨床報(bào)道。
　　 目的:
　　 本實(shí)驗(yàn)用微波輔助萃取法從陜西產(chǎn)“大紅袍”花椒中提取花椒揮發(fā)油，并用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析花椒揮發(fā)油的主要成分。制備花椒揮發(fā)油DMSO溶液。建立豚鼠

9、耳部部位銀屑病樣動(dòng)物模型，通過(guò)5％花椒揮發(fā)油DMSO溶液、20％花椒揮發(fā)油DMSO溶液、及陽(yáng)性對(duì)照藥物（哈西奈德乳膏）平行外用給藥，觀察花椒揮發(fā)油對(duì)銀屑病樣動(dòng)物模型組織學(xué)評(píng)分、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況及心、肝、肺、腎等重要臟器的病理學(xué)影響，旨在探討花椒揮發(fā)油外用對(duì)改善銀屑病樣動(dòng)物模型病理的可行性。同時(shí)采集豚鼠耳部銀屑病樣皮損組織，均漿后用酶聯(lián)免疫法(ELISA)測(cè)定皮損組織中的IFN-γ和IL-4的濃度，研究造模前后及花椒揮發(fā)油治療后，對(duì)豚鼠皮

10、損組織中IFN-γ和IL-4表達(dá)的影響。旨在探討花椒揮發(fā)油溶液外用對(duì)改善銀屑病樣動(dòng)物模型病理可能的機(jī)制。
　　 方法:
　　 微波輔助提取花椒揮發(fā)油，實(shí)驗(yàn)條件為:物料比，花椒(g)∶乙醇(ml)，1:12;微波功率390kw;微波輔助提取時(shí)間6min;提取初始溫度60℃。
　　 GC-MS實(shí)驗(yàn)條件:
　　 色譜條件:AB-5MS毛細(xì)管色譜柱(30m×0.25mm×0.25μm);程序升溫:柱溫起始60℃，

11、保持1min，以3℃/min升至120℃，再以8℃/min升至220℃，保持1min。載氣為He氣，流速1.0ml/min;進(jìn)樣口溫度230℃;分流進(jìn)樣，分流比1:100，進(jìn)樣量為0.02μl;接口溫度為230℃。質(zhì)譜條件:EI源電子能量70eV，離子源溫度230℃;質(zhì)量掃描范圍:45～350amu;溶劑延遲3min。
　　 銀屑病樣動(dòng)物模型的制備:5％心得安軟膏均勻涂抹豚鼠耳部外側(cè)，每日3次，連續(xù)3周，使豚鼠耳部皮膚出現(xiàn)角化過(guò)

12、度、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)增加等典型銀屑病病理改變，建立銀屑病樣模型。
　　 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組處理:
　　 健康成年豚鼠隨機(jī)分為7組。組1:空白對(duì)照組，正常飼養(yǎng)×5W;組2:造模組，造模成功后切取耳部標(biāo)本及臟器標(biāo)本;組3:造模后觀察組，造模成功后不作任何處理，飼養(yǎng)×2W;組4:溶劑對(duì)照組，造模成功后耳部外側(cè)涂40％DMSO溶液，tid×2W;組5:陽(yáng)性對(duì)照組，造模成功后耳部外側(cè)涂哈西奈德乳膏，tid×2W;組6:花椒揮發(fā)油高劑量組，造

13、模成功后耳部外側(cè)涂20％花椒揮發(fā)油DMSO溶液，tid×2W;組7:花椒揮發(fā)油低劑量組，造模成功后耳部外側(cè)涂5％花椒揮發(fā)油DMSO溶液，tid×2W。
　　 組織標(biāo)本的制備:各組豚鼠到預(yù)定時(shí)間后，以頸椎脫位法處死，取耳部標(biāo)本及內(nèi)臟標(biāo)本，10％甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡觀察皮膚病理變化。
　　 豚鼠耳部皮膚組織勻漿樣品的制備:切取各組豚鼠雙側(cè)耳部標(biāo)本，用預(yù)冷生理鹽水沖洗，拭干，分別切取耳部皮膚1.0g，精

14、確稱量，放入含1.0ml生理鹽水的試管中，用高速分散機(jī)10000rpm勻漿兩次，10s/次，用3000rpm離心10min，取上清液待測(cè)。
　　 實(shí)驗(yàn)療效評(píng)估:每只豚鼠兩側(cè)耳部各制作3張切片，光學(xué)顯微鏡10×20視野下隨機(jī)選取5個(gè)視野，利用計(jì)算機(jī)圖像分析軟件，對(duì)選取視野進(jìn)行圖像分析，參照Baker法進(jìn)行組織學(xué)積分評(píng)估，并對(duì)炎癥細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。比較各組數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件，全部數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示

15、，進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，組間均數(shù)比較若方差齊則采用單因素方差分析(One-WayANOVA)，若方差不齊采用校正的Welch方法。若Levene檢驗(yàn)方差齊，用Bonferroni法;若Levene檢驗(yàn)方差不齊，用Dunnett'sT3法，P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 ELISA法檢測(cè)皮損組織中IFN-γ和IL-4的濃度:將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體:洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。加受檢標(biāo)本:使之與固相抗體接觸反應(yīng)一

16、段時(shí)間，讓標(biāo)本中的抗原與固相載體上的抗體結(jié)合，形成固相抗原復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)。加酶標(biāo)抗體:使固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。徹底洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。此時(shí)固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量正相關(guān)。加底物:夾心式復(fù)合物中的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。顏色的深淺和樣品中的IFN-γ和IL-4呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD值)，計(jì)算樣品濃度。
　　 結(jié)果:
　　 1.花椒揮發(fā)油提取及

17、成分分析
　　 提取所得花椒揮發(fā)油為紅褐色，得率12.92％。GC-MS分析主要成分20種。
　　 2.豚鼠耳部皮膚HE染色情況
　　 各組豚鼠耳部組織Baker評(píng)分（(x)±s），進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，Levene檢驗(yàn)方差齊(P=0.076)。單因素方差分析（One-WayANOVA）表明各組Baker評(píng)分（(x)±s）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=236.816，P＜0.001)。
　　 各組豚鼠耳部組織炎癥細(xì)胞

18、浸潤(rùn)計(jì)數(shù)（(x)±s），進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，Levene檢驗(yàn)方差不齊(P＜0.001)，校正的Welch方法的分析結(jié)果表明各組炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)計(jì)數(shù)（(x)±s）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=278.977，P＜0.001)。
　　 組1（正常對(duì)照組）鏡下見(jiàn)皮膚結(jié)構(gòu)完整，表皮層未見(jiàn)角化過(guò)度、角化不全、顆粒層缺乏、棘層肥厚;真皮層未見(jiàn)結(jié)締組織血管擴(kuò)張充血或水腫，真皮內(nèi)散在炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，Baker評(píng)分0.75±0.44，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)22.15±2

19、.82。組2（造模組）鏡下可見(jiàn)表皮層廣泛角化過(guò)度，棘層增厚，皮突延長(zhǎng)并成波浪狀起伏，其中3例可見(jiàn)Munro小膿腫;真皮層內(nèi)血管擴(kuò)張充血、水腫、輕度至中度炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，Baker評(píng)分6.48±0.83，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)90.45±9.18。兩兩比較結(jié)果表明空白對(duì)照組和造模組的Baker評(píng)分及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均小于0.001），提示造模成功。
　　 組3（造模后觀察組）、組4（溶劑對(duì)照組）鏡下所見(jiàn)與組2相似，

20、Baker評(píng)分分別為6.35±0.75和6.10±0.68;炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)分別為88.65±7.60和85.85±8.05。兩兩比較結(jié)果表明組2與組3的Baker評(píng)分及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均等于1.000）;組2與組4的Baker評(píng)分及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=1.000;P=0.850)，提示該病理改變?cè)诓唤邮?％心得安軟膏刺激的情況下可以維持2w不改變，花椒揮發(fā)油溶液基質(zhì)（40％DMSO溶液）無(wú)

21、治療作用。
　　 組5（陽(yáng)性對(duì)照組）、組6（花椒揮發(fā)油高劑量組）、組7（花椒揮發(fā)油低劑量組）鏡下可見(jiàn)皮膚結(jié)構(gòu)完整，表皮層角化過(guò)度程度減輕，棘層增厚程度減輕，皮突延長(zhǎng)程度減輕，未見(jiàn)Munro小膿腫;真皮層內(nèi)血管擴(kuò)張充血、水腫程度減輕，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少。Baker評(píng)分分別為2.45±0.71、3.13±0.56、4.60±0.45;炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)分別為36.35±3.87、40.25±4.06、61.65±5.07。兩兩比較結(jié)果表明

22、組5的Baker評(píng)分及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)與組3相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均小于0.001）;組6的Baker評(píng)分及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)與組3相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均小于0.001）;組7的Baker評(píng)分及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)與組3相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均小于0.001），提示花椒揮發(fā)油溶液對(duì)豚鼠耳部的銀屑病樣病理改變和炎癥現(xiàn)象具有抑制作用。另外，兩兩比較結(jié)果表明組6與組7的Baker評(píng)分及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均小于0

23、.001），提示20％的花椒揮發(fā)油溶液較5％的花椒揮發(fā)油溶液更能改善心得安所致的豚鼠耳部銀屑病樣局部皮膚的病理改變。
　　 3.豚鼠臟器組織HE染色結(jié)果
　　 各組豚鼠心、肝、肺、腎等重要臟器均未見(jiàn)病理性結(jié)構(gòu)改變。
　　 4.ELISA法測(cè)定各組豚鼠皮膚組織勻漿中IFN-γ和IL-4濃度。
　　 各組豚鼠耳部組織勻漿中IFN-γ測(cè)定結(jié)果（(x)±s），進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，Levene檢驗(yàn)方差齊(P=0.42

24、1)，作單因素方差分析(One-WayANOVA)，方差分析表明各組豚鼠耳部組織勻漿中IFN-γ測(cè)定結(jié)果((x)±s)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=130.850，P＜0.001)。
　　 兩兩比較結(jié)果表明與組1比較，組2、組3、組4皮損中的IFN-γ濃度均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均小于0.001）。組2與組3相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均等于1.000）。提示5％心得安軟膏外用致使豚鼠耳部皮損組織中的IFN-γ表達(dá)增加，并不會(huì)在造

25、模2w后以及在空白溶劑基質(zhì)給藥2w后出現(xiàn)下降。
　　 與組3比較，組5、組6、組7皮損中的IFN-γ濃度均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均小于0.001）。組6與組7相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=O.008)。提示花椒揮發(fā)油溶液能夠使豚鼠銀屑病樣皮損組織中IFN-γ的表達(dá)下降，并且與花椒揮發(fā)油的濃度成正相關(guān)。
　　 各組豚鼠耳部組織勻漿中IL-4測(cè)定結(jié)果((x)±s)，進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，Levene檢驗(yàn)方差齊(P=0.590

26、)，作單因素方差分析(One-WayANOVA)，方差分析表明各組豚鼠耳部組織勻漿中IL-4測(cè)定結(jié)果((x)±s)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.796，P=0.578)。
　　 兩兩比較結(jié)果表明與組1（空白對(duì)照組）比較，組2（造模組）、組3（造模后觀察組）和組4（溶劑對(duì)照組）豚鼠耳部組織中IL-4的濃度，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均等于1.000）。與組3（造模后觀察組）比較，組5（陽(yáng)性對(duì)照組）、組6（花椒揮發(fā)油高劑量組）和組7（花椒揮

27、發(fā)油低劑量組）豚鼠耳部組織中IL-4的濃度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均等于1.000）。與組5比較，組6、組7豚鼠耳部組織中IL-4的濃度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均等于1.000）。與組6比較，組7豚鼠耳部組織中IL-4的濃度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=1.000)。提示造模前后未見(jiàn)豚鼠皮損中IL-4的表達(dá)發(fā)生變化，經(jīng)哈西奈德乳膏、濃度為20％和5％花椒揮發(fā)油溶液外用給藥治療后，未見(jiàn)豚鼠皮損中IL-4的表達(dá)發(fā)生變化。
　　 結(jié)論:
　

28、　 1、微波輔助提取條件:微波功率390w、微波輔助提取時(shí)間6min、溶劑用量1:12（g/ml）、提取初始溫度60℃。花椒揮發(fā)油的提取率為12.92％。GC-MS對(duì)花椒揮發(fā)油進(jìn)行分析，通過(guò)MSD化學(xué)工作站進(jìn)行分析，檢索NIST05譜庫(kù)，分別對(duì)總離子流圖中的主要峰進(jìn)行逐一解譜，確定組分20種，占總峰面積的91％。其中最主要的成分為:檸檬烯、桉葉腦、蒎烯等。
　　 2.花椒揮發(fā)油DMSO溶液外用可減輕豚鼠耳部銀屑病樣模型的局部病