抗葡萄球菌蛋白P128表達(dá)、純化及其對(duì)牛源葡萄球菌的抗菌活性研究.pdf

1、抗葡萄球菌嵌合蛋白P128是由葡萄球菌噬菌體K細(xì)胞壁降解酶活性區(qū)與溶葡萄球菌素細(xì)胞壁結(jié)合區(qū)組成的雜合肽，對(duì)耐藥葡萄球菌具有較強(qiáng)的溶（殺）活性。國(guó)外用大腸桿菌成功表達(dá)了重組P128，但需兩步硫酸銨沉淀和離子交換層析純化。本課題組以類彈性蛋白多肽(Elastin-like polypeptide，ELP)為純化標(biāo)簽，用腦膜炎奈瑟氏菌FrpC蛋白自加工元件切割ELP標(biāo)簽，但切割效率較低，重復(fù)性較差。
　　煙草蝕紋病毒(Tobacco e

2、tch virus，TEV)蛋白酶是該病毒核包涵體蛋白酶的催化活性區(qū)，具有識(shí)別序列特異性強(qiáng)、切割活性受目的蛋白氨基酸序列影響小和反應(yīng)兼容性好等優(yōu)點(diǎn)。本課題組研制的自聚肽融合TEV蛋白酶不僅可用離心洗滌法分離純化，而且切割反應(yīng)結(jié)束后能用離心法去除。本研究探索用自聚肽融合TEV蛋白酶切割ELP標(biāo)簽可行性，旨在提高重組P128產(chǎn)量，為相關(guān)基因工程產(chǎn)品開(kāi)發(fā)打好基礎(chǔ)。
　　用PCR擴(kuò)增P128編碼序列，5'端引入TEV蛋白酶切割位點(diǎn)，將PC

3、R產(chǎn)物插入融合表達(dá)載體pELP-Fh8，用重組載體pELP-Fh8-P128轉(zhuǎn)化大腸桿菌，對(duì)IPTG濃度等表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果顯示ELP-Fh8-P128融合蛋白獲得正確表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物為可溶性蛋白。利用溫度敏感相變循化(ITC)純化融合蛋白，對(duì)相變溫度和鹽濃度進(jìn)行了優(yōu)化，經(jīng)兩輪ITC獲得的ELP-Fh8-P128融合蛋白純度達(dá)90％。對(duì)TEV蛋白酶活性包涵體表達(dá)、純化和切割條件進(jìn)行了優(yōu)化，用離心洗滌法獲得了高純度融合蛋白酶。在優(yōu)化條

4、件下切割ELP-Fh8-P128融合蛋白，用ITC去除ELP-Fh8標(biāo)簽，結(jié)果顯示切割效率高達(dá)95％，獲得的重組P128純度達(dá)98％，產(chǎn)量為75mg/L細(xì)菌培養(yǎng)。
　　收集奶牛乳房炎相關(guān)金黃葡萄球菌11株，凝固酶陰性葡萄球菌31株，通過(guò)藥敏試驗(yàn)篩選耐頭孢西丁菌株7株，進(jìn)而用重組P128分別進(jìn)行抑（殺）菌試驗(yàn)，用MTT法檢測(cè)P128對(duì)牛腎細(xì)胞的細(xì)胞毒性。結(jié)果顯示:除對(duì)1株耐頭孢西丁金黃和沃氏葡萄球菌無(wú)效外，重組P128對(duì)9株金黃葡萄