鴨疫里默氏桿菌耐藥相關(guān)基因M949_0011和M949_0459的鑒定及其功能研究.pdf

1、鴨疫里默氏桿菌(Riemerella anatipestifer，RA)是主要感染水禽的細(xì)菌性病原，在世界各地廣泛存在。鴨疫里默氏桿菌感染也被稱為鴨傳染性漿膜炎(Infectious serositis)，鴨疫綜合癥(Anatipestifer syndrome)，鴨敗血癥(Duck septicemia)，新鴨病(New duck syndrome)?；疾〖仪菖R床癥狀以纖維索性心包炎、關(guān)節(jié)炎、肝周炎等為主。慢性感染的水禽還會出現(xiàn)飼料轉(zhuǎn)

2、化率低、產(chǎn)蛋量下降等情況，直接嚴(yán)重影響生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)效益。RA血清型眾多，疫苗交叉保護(hù)率低，因此，對于RA的防控仍然以抗生素為主。由于臨床一線抗生素大量、無序的使用，使得RA對多種抗生素均表現(xiàn)抵抗，但目前對于RA的耐藥性研究多偏向于流行病學(xué)調(diào)查，較少涉及耐藥基因鑒定及機(jī)制研究。本研究我們針對新發(fā)現(xiàn)的RA耐藥相關(guān)基因M949_0011和M949_0459，進(jìn)行了原核表達(dá)和功能分析，主要研究內(nèi)容如下:
　　對RA M949_0011基因進(jìn)行

3、了PCR擴(kuò)增，借助生物信息學(xué)軟件，發(fā)現(xiàn)其編碼框全長為624 bp，編碼207個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)理論分子量約為22.89kDa。BLAST結(jié)果表明，其與1型RA CH-1同源性高，但與2型RA類似蛋白同源性較差。利用原核表達(dá)體系，對RAM949_0011進(jìn)行了體外表達(dá)。
　　我們通過LD50、粘附入侵、血清殺菌、疏水性以及TEM負(fù)染等實(shí)驗(yàn)對RA M949_0011進(jìn)行了生物學(xué)性狀分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該蛋白的缺失使得RA毒力下降（大約1

4、00倍以上），黏附入侵能力減弱，血清抵抗力增強(qiáng)，細(xì)菌疏水性增強(qiáng)，細(xì)菌表面莢膜多糖分泌減少，證明該基因編碼蛋白可能與RA外膜結(jié)構(gòu)相關(guān)，也與RA的毒力和致病性相關(guān)。藥物試驗(yàn)表明，亞胺培南可以導(dǎo)致M949_0011突變株在固體表面更易聚集。暗示其可能與RA對藥物的抵抗相關(guān)聯(lián)。
　　使用PCR擴(kuò)增技術(shù)對RA M949_0459基因進(jìn)行原核表達(dá)，借助生物信息學(xué)軟件分析表明，該基因編碼框全長1161 bp，編碼386個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)理論分子量

5、為42.53 kDa。藥敏實(shí)驗(yàn)表明，該M949_0459基因原核表達(dá)菌株，顯著增強(qiáng)了宿主菌大腸桿菌對替加環(huán)素的MIC（大約6倍左右）。利用qRT-PCR技術(shù)，檢測不同濃度替加環(huán)素對RAM949_0459基因誘導(dǎo)作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，替加環(huán)素對RAM949_0459基因的誘導(dǎo)作用為線性，在藥物濃度4 mg/L以下，其表達(dá)量隨著藥物的增加而增加，藥物濃度在4 mg/L和10 mg/L之間，其表達(dá)量呈下降趨勢，這表明，RA可能存在另外的替加環(huán)素