CUL4BE3泛素連接酶調控HBV復制的分子機制研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(Hepatitis Bvirus，HBV)屬于嗜肝DNA病毒科，感染肝細胞后可以引起急性肝炎、慢性肝炎和重型肝炎。雖然乙肝疫苗的應用使HBV感染率有所下降，但目前全世界仍有20億人感染HBV，其中約3.5億人是HBV慢性感染者，仍然是肝細胞肝癌(HCC)發(fā)生的主要危險因素之一，嚴重危害人類的健康。因此，研究HBV復制的調控機制，發(fā)現(xiàn)能夠清除HBV感染、阻斷HBV相關疾病發(fā)展的潛在靶點，將為臨床診治提供新的契機。
　　

2、泛素蛋白酶體途徑可通過介導蛋白質的泛素化修飾，促進體內蛋白質的降解，參與調節(jié)細胞的眾多生物學功能，在維持細胞和機體內環(huán)境穩(wěn)定過程中發(fā)揮重要作用。在真核細胞中，泛素活化酶E1、泛素結合酶E2和泛素連接酶E3共同催化泛素分子的轉移反應，促進蛋白質的泛素化降解。其中，E3泛素連接酶通過特異性地識別底物蛋白，介導泛素高特異性的連接到不同的蛋白質上，在此途徑中扮演著重要的角色。近年來，有研究證明泛素蛋白酶體途徑參與調控HBV的復制周期。使用蛋白酶

3、體抑制劑硼替佐米(bortezomib)注射HBV轉基因小鼠能夠顯著降低HBVDNA的含量，同時，干擾素抑制HBV的復制依賴于蛋白酶體的活性。但也有研究發(fā)現(xiàn)，在HBV轉基因小鼠以及注射了HBV全基因表達質粒的C57BL/6小鼠中發(fā)現(xiàn)使用蛋白酶體抑制劑MLN-273卻能促進HBV的復制。因此蛋白酶體途徑與HBV復制之間的關系還不是很清楚。
　　CUL4B是近年在X連鎖精神發(fā)育遲滯疾病中克隆、發(fā)現(xiàn)的一個新致病基因，其突變可以引起患者智

4、力低下、失語、巨大舌、身材矮小等。CUL4B屬于Cullin-RING基因家族的一員。人體內已經(jīng)鑒定存在8個Cullin家族基因，分別為CUL1、CUL2、CUL3、CUL4A、CUL4B、CUL5、CUL7和PARC，每一個cullin蛋白都能組裝成獨特的E3泛素連接酶復合物，參與調控細胞周期、細胞的增生與分化、DNA復制與修復、信號轉導、病毒感染等各種細胞生命過程，對維持細胞的正常生理功能具體非常重要的作用。
　　關于CUL4

5、BE3泛素連接酶是否參與調節(jié)HBV復制，目前尚無報道。因此，本課題對于CUL4BE3泛素連接酶在HBV感染中的作用及其分子機制進行了初步的探討。
　　研究目的:
　　1.研究CUL4B對HBV復制的影響。
　　2.探討CUL4B調控HBV復制的分子機制，為抗病毒治療方案提供科學依據(jù)。
　　研究方法：
　　1.CUL4B對HBV復制的調控作用
　　1.1臨床標本和HBV轉基因鼠分析CUL4B與HBV復制

6、的相關性
　　1.1.1臨床肝組織標本中分析CUL4B與HBV復制的相關性
　　收集43例HBV陽性的肝組織標本，提取肝組織RNA，real-timePCR檢測CUL4BmRNA、HBVpgRNA的水平;提取肝組織基因組DNA，real-timePCR檢測HBVcccDNA;統(tǒng)計學分析CUL4B表達水平與HBV復制指標之間的相關性。
　　1.1.2HBV轉基因小鼠中分析CUL4B與HBV的復制的相關性
　　6～8

7、周齡雄性、BalB/C系HBVTg鼠，提取肝臟組織的RNA，利用real-timePCR檢測CUL4BmRNA、HBVpgRNA的水平，提取肝組織基因組DNA，real-timePCR檢測HBVcccDNA;分離小鼠血清，real-timePCR檢測血清中HBVDNA水平;統(tǒng)計學分析CUL4B表達水平與HBV復制相應指標之問的相關性。
　　1.2CUL4B調控HBV復制的體內研究
　　1.2.1利用CUL4B轉基因鼠研究CU

8、L4B對HBV復制的影響
　　6～8周齡雄性CUL4B轉基因鼠（CD1系，EGFP-CUL4BTg）及相應野生型小鼠，尾靜脈高壓注射HBV全基因組表達質粒pcDNA3-HBV1.1，ELISA方法檢測外周血HBsAg、HBeAg水平，real-timePCR方法檢測兩組小鼠肝組織CUL4BmRNA、HBVcccDNA、HBVpgRNA水平，統(tǒng)計學分析CUL4B與HBV復制指標之間的相關性。
　　1.2.2利用Mx1-CreC

9、UL4BFlox/Y條件敲除鼠研究CUL4B對HBV復制的影響
　　6～8周齡雄性條件性CUL4B基因敲除鼠(C57BL/6系，Mx1-CreCUL4BFlox/Y)及其相應野生型小鼠，PIPC處理5天后，尾靜脈高壓注射HBV全基因組表達質粒pcDNA3-HBV1.1，ELISA方法檢測外周血HBsAg、HBeAg水平，real-timePCR方法檢測兩組小鼠肝組織CUL4BmRNA、HBVcccDNA、HBVpgRNA水平，統(tǒng)計

10、學分析CUL4B與HBV復制相應指標之間的相關性。
　　1.3CUL4B調控HBV復制的體外研究
　　HepG2.2.15細胞轉染CUL4B-mi表達質粒或陰性對照Neg-mi表達質粒，BEL7402細胞、HepG2細胞、Hela細胞中分別共轉HBV全基因組表達質粒和CUL4B-miRNA或陰性對照Neg-miRNA質粒，或在HepG2細胞中共轉染CUL4B過表達質粒和HBV全基因組表達質粒。利用Westernblot、Re

11、al-timePCR方法檢測CUL4B的干擾或過表達效果以及HBVcccDNA，HBVpgRNA水平，ELISA方法檢測細胞上清HBsAg、HBeAg水平，分析CUL4B過表達或沉默對HBV復制水平的影響。
　　2.HBx在CUL4B調控HBV復制中的作用
　　將CUL4B過表達質粒或對照質粒分別與pcDNA3-HBV1.1（HBx蛋白野生型組）或pcDNA3-HBV1.1(△HBx)（HBx蛋白表達缺失組）或pcDNA3-

12、HBV1.1(△HBx)+pcDNA3-HBx-HA（HBx拯救組）共轉染HepG2細胞中。ELISA檢測HBsAg、HBeAg的分泌，real-timePCR檢測CUL4BmRNA、HBVpgRNA、HBVcccDNA水平，分析HBx在CUL4B調控HBV復制中的作用。
　　3.HBx蛋白參與CUL4B調控HBV復制的的機制研究
　　3.1HBx蛋白與CUL4B復合體的結合作用
　　將HBx過表達質粒轉染HEK293

13、細胞中，轉染24h后用免疫共沉淀裂解液處理細胞，收獲蛋白收獲蛋白利用HA抗體或CUL4B抗體進行免疫共沉淀，Westernblot檢測CUL4B、DDB1、Roc1和HBx-HA的表達情況，驗證HBx與CUL4B復合體的相互結合作用。
　　3.2CUL4B復合體對HBx蛋白表達的影響
　　將HBx表達質粒與CUL4B過表達質?；駽UL4B-miRNA或相關對照質粒共轉染HEK293細胞、HepG2細胞、SMMC7721細胞，

14、通過RT-PCR和westernblot驗證CUL4B對HBx表達的影響;將CUL4B拯救質粒與HBx表達質粒共轉染CUL4B低表達的HEK293細胞、Hela細胞，Westernblot檢測HBx蛋白的表達變化，進一步驗證CUL4B對HBx表達的影響。此外，將HBx表達質粒與DDB1siRNA或ROC1siRNA共轉染HEK293細胞，Westernblot檢測HBx蛋白的表達情況，驗證DDB1、ROC1對HBx表達的影響。
　

15、　3.3CUL4B對HBx蛋白半衰期的影響
　　將HBx表達質粒轉染CUL4B低表達或對照HEK293細胞，經(jīng)蛋白合成抑制劑放線菌酮(CHX)處理后，收集不同時間點的細胞蛋白，westernblot檢測HBx蛋白的表達變化，觀察CUL4B對HBx蛋白半衰期的影響。
　　3.4CUL4B對HBx蛋白降解的調控作用
　　將CUL4BsiRNA或陰性對照NCsiRNA與HBx表達質粒共轉染Hela細胞、HEK293細胞、He

16、pG2細胞、SMMC7721細胞，并用蛋白酶體抑制劑MG132處理細胞，Westernblot檢測HBx蛋白的表達變化，明確CUL4B對HBx蛋白降解的調控作用。
　　3.5CUL4B對HBx蛋白泛素化修飾的影響
　　將HBx過表達質粒轉染CUL4B低表達或對照HEK293細胞，蛋白酶體抑制劑MG132處理細胞后，利用HA抗體進行免疫共沉淀，westernblot檢測泛素分子的表達，觀察CUL4B對HBx蛋白泛素化修飾的影響

17、。
　　研究結果：
　　1.CUL4B正向調控HBV的復制
　　1.1臨床標本和HBV轉基因鼠中CUL4B表達與HBV復制呈現(xiàn)正相關性
　　1.1.1臨床肝組織標本中CUL4B表達與HBV復制水平呈正相關
　　Real-timePCR檢測HBV陽性肝組織中CUL4B、HBVpgRNA和HBVcccDNA表達，統(tǒng)計學分析結果顯示，CUL4BmRNA水平與HBV陽性患者肝組織中HBVpgRNA和HBVcccDN

18、A水平均呈現(xiàn)正相關性。
　　1.1.2HBV轉基因鼠中CUL4B表達與HBV復制水平呈現(xiàn)正相關性
　　Real-timePCR檢測HBV轉基因鼠肝組織中CUL4B、HBVpgRNA和HBVcccDNA表達及血清中HBVDNA水平，統(tǒng)計學分析結果顯示，CUL4BmRNA水平與HBV轉基因鼠肝組織中HBVpgRNA、HBVcccDNA水平及血清中HBVDNA水平均呈現(xiàn)正相關性。
　　1.2體內實驗證實CUL4B可促進HBV

19、復制
　　1.2.1CUL4B轉基因鼠可上調HBV復制水平
　　CUL4B轉基因鼠和野生型對照小鼠經(jīng)尾靜脈高壓注射HBV表達質粒后，Real-timePCR結果顯示:CUL4B轉基因鼠肝臟組織中CUL4BmRNA顯著高于野生型對照組小鼠，同時肝組織中pgRNA、cccDNA表達水平亦顯著升高;ELISA結果顯示:CUL4B轉基因小鼠血清中HBsAg、HBeAg水平明顯高于野生型小鼠，提示CUL4B高表達可正向調節(jié)HBV復制。

20、
　　1.2.2Mx1-CreCUL4BFlox/Y基因敲除鼠可抑制HBV復制
　　Mx1-CreCUL4BFlox/Y小鼠與野生型對照小鼠經(jīng)PIPC處理后，尾靜脈高壓注射HBV表達質粒，Real-timePCR結果顯示:Mx1-CreCUL4BFlox/Y小鼠肝臟組織中CUL4BmRNA明顯低于對照組，同時pgRNA、cccDNA水平顯著降低;ELISA結果顯示:Mx1-CreCUL4BFlox/Y小鼠血清中HBsAg、H

21、BeAg水平顯著低于野生型小鼠，進一步提示CUL4B可在體內促進HBV復制。
　　1.3體外實驗進一步驗證CUL4B對HBV復制的正向調節(jié)作用
　　肝癌細胞系過表達CUL4B表達、轉染HBV基因表達質粒后，CUL4B過表達可上調細胞中pgRNA、cccDNA水平及上清中HBsAg、HBeAg水平;與之相反，干擾肝癌細胞中CUL4B表達，可下調細胞中pgRNA、cccDNA水平及上清中HBsAg、HBeAg水平，進一步驗證了C

22、UL4B對HBV復制的促進作用。
　　2.HBx蛋白參與CUL4B對HBV復制的調節(jié)作用
　　HepG2細胞分別共轉染CUL4B表達質粒與HBV全基因表達質粒、HBx缺失型HBV質粒HBV(△HBx)或經(jīng)HBx質粒拯救的HBx缺失型HBV質粒后，與HBV全基因表達質粒轉染組相比，HBx缺失型HBV質粒轉染細胞中pgRNA、cccDNA水平和HBsAg、HBeAg分泌水平顯著降低，而HBx表達質?？苫謴虷Bx缺失型HBV質粒轉

23、染細胞的復制水平，進一步證實HBx在HBV復制中的重要作用。CUL4B過表達可顯著上調HBV全基因轉染細胞中pgRNA、cccDNA水平和HBsAg、HBeAg分泌水平，而對HBV(△HBx)轉染細胞中病毒復制的影響有所減弱，HBx過表達可恢復CUL4B對HBV(△HBx)轉染細胞中病毒復制的促進作用。
　　3.CUL4B調控HBx蛋白泛素化降解過程
　　3.1HBx可與CUL4B復合體相結合
　　HEK293細胞過表

24、達HBx，轉染24h后用免疫共沉淀裂解液裂解細胞，收獲蛋白進行免疫共沉淀試驗，Westernblot結果顯示，HBx可以與CUL4B、DDB1、ROC1相互結合。
　　3.2CUL4B復合體上調HBx蛋白的表達
　　肝癌細胞、HEK293細胞和Hela細胞中，過表達或干擾CUL4B觀察HBxmRNA和蛋白的表達變化。RT-PCR結果顯示:過表達或干擾CUL4B對HBxmRNA水平無明顯影響;westernblot結果顯示:過

25、表達CUL4B能夠上調HBx蛋白的表達，相反地，干擾CUL4B能夠抑制HBx蛋白的表達，且CUL4B拯救質粒能夠劑量依賴性地恢復CUL4B低表達細胞中HBx蛋白的表達。以上結果提示，CUL4B能夠上調HBx蛋白的表達。HEK293細胞分別轉染DDB1siRNA、ROC1siRNA，Westernblot結果顯示:干擾DDB1或ROC1的表達均可以抑制HBx蛋白的表達，以上結果提示:CUL4B復合體可上調HBx蛋白的表達。
　　3.

26、3CUL4B可延長HBx蛋白的半衰期
　　為進一步研究CUL4B影響HBx蛋白表達的分子機制，課題檢測了CUL4B對HBx蛋白半衰期的影響。經(jīng)蛋白合成抑制劑放線菌酮(CHX)處理后不同時間點，CUL4B低表達的穩(wěn)篩細胞系HEK293中HBx蛋白的表達顯著低于對照組細胞。且CUL4B低表達細胞中HBx蛋白的降解速率顯著高于對照組細胞。提示:CUL4B通過延長HBx半衰期進而上調HBx蛋白的表達。
　　3.4CUL4B抑制HBx

27、蛋白的蛋白酶體降解途徑
　　已有研究證實，HBx蛋白主要通過泛素-蛋白酶體途徑降解。為研究蛋白酶體降解途徑在CUL4B調控HBx蛋白表達中的作用，課題利用蛋白酶體抑制劑MG132處理細胞，westernblot結果顯示:干擾CUL4B表達可顯著降低HBx的表達，而MG132可逆轉CUL4B低表達對HBx蛋白表達的抑制作用。提示CUL4B可能通過影響泛素-蛋白酶體途徑調控HBx蛋白的表達。
　　3.5CUL4B抑制HBx蛋白泛

28、素化修飾
　　為進一步研究泛素-蛋白酶體降解途徑在CUL4B調控HBx蛋白表達中的作用，課題檢測了CUL4B對HBx泛素化修飾的影響。利用HA抗體進行免疫共沉淀，westernblot檢測泛素水平，結果顯示CUL4B低表達細胞中HBx-HA的泛素化水平顯著高于對照組細胞，提示CUL4B可通過抑制HBx蛋白的泛素化修飾，進而阻斷HBx蛋白的蛋白酶體降解途徑。
　　研究結論與研究意義：
　　1.首次發(fā)現(xiàn)CUL4BE3泛素連