皮膚鱗狀細(xì)胞癌與基底細(xì)胞癌9號染色體雜合性丟失及PTCH1表達(dá)的研究.pdf

1、目的： 皮膚鱗狀細(xì)胞癌(squamous cell carcinoma，SCC)和基底細(xì)胞癌(basal cellcarcinoma，BCC)的發(fā)生是多因素、多階段、多基因共同作用所致，涉及多種癌基因的激活和抑癌基因的失活。用DNA多態(tài)性標(biāo)記腫瘤染色體特定位點(diǎn)，分析其雜合性丟失(loss of heterozygosity，LOH)已廣泛用于抑癌基因(tumor suppressorgene，TSG)的篩選和機(jī)制的研究。SCC與

2、BCC有著不同的生物學(xué)行為和病理學(xué)特征，提示這兩種腫瘤的發(fā)生機(jī)制不盡相同，因此探討SCC與BCC相關(guān)基因及其表達(dá)產(chǎn)物可以為臨床診療提供標(biāo)記物。PTCH1(human homolog of the Drosophila pathed1，PTCHl)為TSG表達(dá)的一種蛋白，在多種腫瘤發(fā)生的Hedgehog信號傳導(dǎo)通路中發(fā)揮重要作用；因此有必要探討其在SCC、BCC表達(dá)情況，為SCC、BCC的診斷和治療提供可能的分子靶標(biāo)。 近來LOH

3、研究顯示染色體9p21-22和9q22-23缺失頻率較高，提示9p21-22和9q22-23內(nèi)可能存在與SCC、BCC發(fā)生有關(guān)的抑癌基因。為證實(shí)SCC、BCC與9號染色體雜合性丟失的相關(guān)性，本研究利用激光捕獲顯微切割(laser capturemicrodissection，LCM)技術(shù)特異性捕獲腫瘤細(xì)胞，將其PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與外周血DNA的PCR產(chǎn)物對比進(jìn)行LOH分析。本研究選擇了5個微衛(wèi)星多態(tài)性標(biāo)記，3個位于9p21-22區(qū)域，2個位

4、于9q22-23區(qū)域，分析26例BCC和10例SCC的LOH缺失情況，以期確定其是否與腫瘤發(fā)生有關(guān)。并進(jìn)一步應(yīng)用免疫組化技術(shù)分析PTCH1蛋白在SCC及BCC中的表達(dá)情況及意義。 方法： LOH樣本：26例BCC，10例SCC新鮮組織標(biāo)本，OCT包埋，-80℃保存?zhèn)溆?，診斷均經(jīng)病理證實(shí)。顯微切割特異性捕獲腫瘤細(xì)胞：7μm連續(xù)冷凍切片，采用SLμCut顯微分離系統(tǒng)捕獲腫瘤細(xì)胞約4000個。腫瘤細(xì)胞DNA的提取與PCR擴(kuò)增

5、：腫瘤細(xì)胞DNA的提取參照QIAamp DNA Mini Kit試劑盒說明書，對目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。微衛(wèi)星多態(tài)性標(biāo)記的選擇參考文獻(xiàn)報道，從UCSC人類基因組數(shù)據(jù)庫獲得微衛(wèi)星序列。LOH分析：取10μ1PCR產(chǎn)物與10μ1甲酰胺上樣緩沖液混合，95℃變性10min，冰冷5分鐘。加樣10μ1于8％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(含7M尿素)，80v電泳2.5h，硝酸銀染色，觀察等位片段大小和信號強(qiáng)度，判斷結(jié)果。與正常組織相比，癌組織條帶消失或相

6、對密度減少50％以上時判斷為LOH。若癌組織條帶增多或位移則判斷為微衛(wèi)星不穩(wěn)定(microsatellite instability，MSI)。 免疫組織化學(xué)：標(biāo)本8例BCC，26例SCC，5例正常皮膚石蠟包埋，5μm連續(xù)切片，PTCH1抗體購自北京奧維亞生物技術(shù)公司，稀釋濃度為1:200，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木蘇復(fù)染，胞內(nèi)見均一的棕黃色顆粒為陽性。400倍鏡下計(jì)數(shù)5個視野或者1000個細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞所占的百分?jǐn)?shù)，

7、染色細(xì)胞≥20％為陽性，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)過SPSS13.0f進(jìn)行x2驗(yàn)檢分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 一、26例BCC的5個位點(diǎn)中，D9S196 LOH頻率為11.5％(3/26)，D9S916為7.7％(2/26)，D9S974MSI為15.4％(4/26)，D9S1814LOH的頻率為最高15.4％(4/26)，D9S176未發(fā)現(xiàn)LOH及MSI。 二、10例SCC雜合性丟失研究顯示：D9S974

8、MSI為10％(1/10)，D9S176、D9S1814、D9S196及D9S916均未見LOH及MSI。 三、免疫組化染色：5例正常皮膚陽性率為20％(1/5)，8例BCC均為陽性100％，28例SCC陽性率為92.3％(24/26)。 結(jié)論： 一、在BCC中，與D9S1814連鎖的P15基因，D9S974連鎖的P16基因，可能與BCC的發(fā)生相關(guān)。 二、PTCH1基因內(nèi)D9S176及D9S196兩個微衛(wèi)

9、星多態(tài)性標(biāo)記的LOH頻率明顯低于國外，推測其在SCC、BCC的發(fā)生中可能存在種族差異。 三、BCC與SCC在9號染色體發(fā)生LOH位點(diǎn)不同，兩者機(jī)制不同。 四、SCC、BCC與正常皮膚相比PTCH1蛋白高表達(dá)，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，SCC與BCC之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。PTCH1高表達(dá)可通過激活Hedgehog信號通路在SCC、BCC發(fā)生過程起重要作用。 五、不同病理分期的SCC中PTCH1蛋白