深海環(huán)境中未培養(yǎng)古菌多樣性和代謝途徑分析的研究.pdf

1、甲烷是大氣中含量最為豐富的碳?xì)浠衔?同時(shí)也是重要的溫室氣體之一。海洋中厭氧甲烷氧化(AOM)主要由ANME(the anaerobic methanotrophic archaea)介導(dǎo),目前還未獲得ANME的純培養(yǎng),其相關(guān)代謝途徑還存在很多的未知。通過(guò)對(duì)Cadiz海灣泥火山樣品進(jìn)行高壓厭氧流動(dòng)富集培養(yǎng),成功獲得 ANME-2a的富集物。本研究通過(guò)對(duì)ANME-2a富集物構(gòu)建fosmid文庫(kù),然后利用古菌16S rRNA和AOM代謝途徑

2、中的關(guān)鍵功能基因進(jìn)行篩選。對(duì)篩選得到的38個(gè)目的fosmid雙酶切后,從中挑取24個(gè)進(jìn)行測(cè)序和分析,進(jìn)而為富集物中古菌的代謝途徑研究提供指導(dǎo)。通過(guò)fosmid中AOM關(guān)鍵基因與ANME-2a的單細(xì)胞團(tuán)基因組中相應(yīng)數(shù)據(jù)的比對(duì)及進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建,發(fā)現(xiàn)了唯一一個(gè)MBGD類(lèi)群來(lái)源的fosmid克隆6A10,有19個(gè)fosmid來(lái)源于ANME-2a類(lèi)群。對(duì)MBGD類(lèi)群來(lái)源的的片段6A10進(jìn)行ORF預(yù)測(cè)及注釋,發(fā)現(xiàn)該片段包含嘌呤代謝、嘧啶代謝、糖代謝及異

3、戊烯基代謝等功能基因。在ANME-2a類(lèi)群來(lái)源的fosmid片段中,重點(diǎn)關(guān)注甲烷代謝相關(guān)的功能基因,并與ANME-1和其它甲烷產(chǎn)生菌中對(duì)應(yīng)的基因進(jìn)行比較和進(jìn)化分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn) ANME-2a的對(duì)應(yīng)的功能酶來(lái)源于Methanosarcinales目,而缺乏mer基因的ANME-1則與其親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。同時(shí),我們首次從ANME-2a的基因組中找到兩個(gè)mer基因:mer1和mer2,其中mer1屬于Methanosarcinales目,mer2與

4、mtr基因連鎖,在進(jìn)化樹(shù)上形成單獨(dú)的一支,這兩個(gè)蛋白的生理和功能特性還有待進(jìn)一步的研究。
　　深海熱液口由于劇烈的溫度(可達(dá)到400℃以上)、pH和化學(xué)梯度,成為地球生命起源和演化研究的焦點(diǎn),海底熱液口生命系統(tǒng)為人類(lèi)提供了一個(gè)探索深部生命及生命起源和進(jìn)化的窗口。本碩士論文的另一個(gè)研究?jī)?nèi)容是對(duì)瓜伊馬斯深海熱液口高溫環(huán)境下沉積物和煙囪樣品中古菌多樣性的研究。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR首先對(duì)樣品中古菌進(jìn)行定量,沉積物和煙囪中古菌分別達(dá)到1.

5、47×109拷貝數(shù)/g和5.29×108拷貝數(shù)/g(濕重)。通過(guò)核糖體小亞基16S rRNA基因文庫(kù)的構(gòu)建,發(fā)現(xiàn)沉積物和煙囪樣品中的古菌類(lèi)群多數(shù)是嗜熱和超嗜熱微生物,但兩個(gè)樣品中的古菌群落組成差異很大:沉積物以泉古菌門(mén)為主,優(yōu)勢(shì)菌群為 Miscellaneous Crenarchaeota Group( MCG)和Hot Water Crenarchaeota GroupⅠ(HWCGⅠ);煙囪樣品則主要是廣古菌門(mén)類(lèi)群,其中以Thermo

6、coccales, Marine Benthic Group D(MBGD)和Deep Hydrothermal Vent Euryarchaeota(DHVE)為主。在沉積物樣品中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的MCG類(lèi)群,命名為MCG-H,可能是MCG的高溫獨(dú)特類(lèi)群。研究揭示,在瓜伊馬斯深海熱液口煙囪和沉積物中都包含有豐富的古菌類(lèi)群,其中包括未被發(fā)現(xiàn)的新類(lèi)群。對(duì)瓜伊馬斯深海熱液口古菌分布和多樣性的研究將為進(jìn)一步深入的古菌生理功能和演化的研究提供基礎(chǔ)。