高糖狀態(tài)下腎組織基質(zhì)金屬蛋白酶2和9表達(dá)的研究.pdf

1、糖尿病的患病率在全球正以驚人的速度逐年增長，尤其是在包括我國在內(nèi)的亞洲發(fā)展中國家。糖尿病腎病是糖尿病最主要的慢性并發(fā)癥之一，是糖尿病致死致殘的重要原因，給病人和社會帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。糖尿病腎病的主要病理特點(diǎn)是腎臟增大，腎小球基底膜增厚及以腎小球系膜區(qū)為主的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)積聚，導(dǎo)致彌漫性或結(jié)節(jié)性腎小球硬化，合并腎小管間質(zhì)的纖維化，從而出現(xiàn)蛋白尿、高血壓、腎功能衰竭等功能紊亂。其中Ⅳ型膠原(C-Ⅳ)是腎小球基底膜和ECM的主要成分，

2、參與C-Ⅳ降解的主要蛋白水解酶是基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)和基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)，研究腎組織MMP-2和MMP-9在高糖狀態(tài)下的改變可提示是否存在C-Ⅳ降解途徑的異常。另外，近年的研究表明轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展中起著十分重要的作用，甚至有學(xué)者將之稱為糖尿病腎病治療的靶點(diǎn)，在糖尿病腎病中TGF-β1的改變直接與C-Ⅳ積聚相關(guān)，那么是否也與基質(zhì)金屬蛋白酶相關(guān)呢?另外，噻唑烷二酮類作為一類治療糖尿

3、病的新藥，已被發(fā)現(xiàn)具有腎臟保護(hù)作用，但其保護(hù)糖尿病腎臟的作用機(jī)制還不明確，是否也影響了糖尿病腎臟基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)?內(nèi)源存在的蛋白聚糖Ⅱ(Decorin，DCN)通過參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化，調(diào)節(jié)基質(zhì)形成及膠原纖維的結(jié)構(gòu)和生成速度，發(fā)揮抗纖維化的作用。 第一部分糖尿病大鼠腎小球基質(zhì)金屬蛋白酶2和9表達(dá)的研究 目的:糖尿病腎病(DN)是導(dǎo)致終末期腎病的主導(dǎo)因素，也是糖尿病患者致死、致殘的主要原因。在高血糖條件下，腎小球系

4、膜細(xì)胞對細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分合成和分解代謝的紊亂直接導(dǎo)致了糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展。同時(shí)，越來越多的證據(jù)表明系膜自分泌的轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)的活性介導(dǎo)了高血糖對腎臟的作用，而且TGF-β是人類和實(shí)驗(yàn)性糖尿病腎小球硬化發(fā)展的主要決定因素。 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和方法:32只SD大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ，70mg/kg)誘發(fā)糖尿病，另18只作為對照，在2周、4周、8周取腎標(biāo)本行常規(guī)病理檢查，用MMP-2、MMP-9、C-Ⅳ單克

5、隆抗體及TGF-β1多克隆抗體標(biāo)記進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色經(jīng)圖象分析儀分析。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:32只大鼠(雌雄各半)經(jīng)STZ注射，72h后有27只造模成功。常規(guī)病理檢查發(fā)現(xiàn)糖尿病組8周時(shí)可見腎小球系膜輕度增生、腎小管輕度顆粒樣變，基底膜輕度增厚、僵硬。 結(jié)論:1.STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎小球MMP-2的表達(dá)在2周即有下降，伴隨C-Ⅳ和TGF-β1的表達(dá)上升，隨病程的延長這些變化更為明顯。 2.在糖尿病大鼠中用免疫組化方法未

6、發(fā)現(xiàn)腎小球MMP-9的表達(dá)的改變。 第二部分吡格列酮對糖尿病大鼠腎組織基質(zhì)金屬蛋白酶2和9表達(dá)的影響 目的:近年來開展了大量有關(guān)糖尿病藥物研發(fā)的工作，解決了糖尿病治療中的一些問題，同時(shí)也潛在地改變了這種疾病的治療模式。過氧化物酶增殖物激活受體噻唑烷二酮類(TZD)是一類治療糖尿病的新藥，已被證明可降低培養(yǎng)的人單核細(xì)胞分泌MMP-9的水平，且有腎臟保護(hù)的作用，而關(guān)于其在糖尿病腎病中的作用機(jī)制尚未明確。所以我們研究糖尿病大鼠用

7、吡格列酮治療前后TGF-β1、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)和Ⅳ型膠原(C-Ⅳ)在腎組織中表達(dá)的改變及其意義。由于糖尿病時(shí)腎小球和腎間質(zhì)均存在纖維化，所以我們分別分析TGF-β1、MMP-2、MMP-9、C-Ⅳ在腎小球和腎間質(zhì)的表達(dá)。 方法:與第一部分實(shí)驗(yàn)同步進(jìn)行，25只SD大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ，70mg/kg)誘發(fā)糖尿病，以吡格列酮(20mg·kg-1·d-1)治療，在2周、4周、8周

8、取腎標(biāo)本行常規(guī)病理檢查，用MMP-2、MMP-9、C-Ⅳ和TGF-β1單克隆抗體行免疫組織化學(xué)染色后經(jīng)圖象分析儀分別分析TGF-β1、MMP-2、MMP-9、C-Ⅳ在腎小球和腎間質(zhì)的表達(dá)，與第一部分結(jié)果一起分析。 結(jié)果:2周、4周、8周時(shí)糖尿病組大鼠腎小球MMP-2較正常對照組明顯下降(P＜0.05)，吡格列酮治療組腎小球MMP-2高于糖尿病組，在4周、8周時(shí)差異有顯著性(P＜0.05)；吡格列酮治療組腎小球MMP-2在2周時(shí)較

9、正常對照組表達(dá)減少(P＜0.05)，而在8周時(shí)則較正常對照組增加(P＜.05)。各時(shí)點(diǎn)糖尿病組大鼠腎間質(zhì)MMP-2較對照組有增高趨勢，但未顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。吡格列酮治療組較糖尿病組腎間質(zhì)MMP-2有下降，第8周時(shí)差異有顯著性(P＜0.05)；且吡格列酮治療8周腎間質(zhì)MMP-2表達(dá)較正常對照組表達(dá)減少(P＜0.05)。 結(jié)論1.糖尿病時(shí)伴有腎小球MMP-2表達(dá)水平的下降，使C-Ⅳ降解減少，從而引起C-Ⅳ表達(dá)增加，可能

10、是引起細(xì)胞外基質(zhì)積聚、腎小球硬化的原因之一。 2.在腎間質(zhì)與腎小球不同，糖尿病時(shí)MMP-2表達(dá)水平反而較對照組為高，可能是一個(gè)代償?shù)倪^程。 3.吡格列酮治療可改善糖尿病大鼠腎小球與腎間質(zhì)不同方向改變的異常MMP-2的水平：即在腎小球，增加糖尿病時(shí)腎小球MMP-2表達(dá)水平，降低C-Ⅳ的表達(dá)，從而可能延緩腎纖維化的進(jìn)展；而在腎間質(zhì)，則可能先通過另外途徑降低C-Ⅳ的表達(dá)，使代償性升高的MM-2水平下降。 第三部分Dec

11、orin重組腺病毒載體對高糖環(huán)境下腎組織細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶2和9表達(dá)的影響 目的:在高血糖條件下，腎小球系膜細(xì)胞和腎小管細(xì)胞對細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分合成和分解代謝的紊亂直接導(dǎo)致了糖尿病腎病(DN)的發(fā)生和發(fā)展。同時(shí)，越來越多的證據(jù)表明系膜自分泌的轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)的活性介導(dǎo)了高血糖對腎臟的作用，而且TGF-β是人類和實(shí)驗(yàn)性糖尿病腎小球硬化發(fā)展的主要決定因素。在高糖條件下下調(diào)TGF-β信號的治療途徑為我們提供了一個(gè)抑

12、制DN發(fā)生、發(fā)展的策略。蛋白聚糖Ⅱ，又稱decorin(DCN)能通過其核心蛋白與TGF-β1結(jié)合直接中和其活性。本實(shí)驗(yàn)旨在探討高糖條件下，高水平表達(dá)的decorin調(diào)節(jié)TGF-β1，抑制ECM積聚的作用，以及對MMP-2和MMP-9表達(dá)的影響。 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和方法:本實(shí)驗(yàn)將大鼠DCN重組腺病毒載體Ad/DCN和抗TGF-β中和抗體處理不同糖濃度培養(yǎng)條件下的大鼠腎系膜細(xì)胞(RMCs)和腎小管細(xì)胞(HK-2)，用Westernblot

13、法觀察感染72h后decorin蛋白水平變化及其對TGF-β1和細(xì)胞外基質(zhì)C-Ⅳ以及基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)和基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)表達(dá)水平的影響。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:在處理后72h的RMCs細(xì)胞中，DCN蛋白的表達(dá)在低糖培養(yǎng)組較低，在PBS高糖對照組及Ad/LacZ載體對照組及抗TGF-β中和抗體陽性對照組均有所升高，至Ad/DCN感染組則有更顯著的升高；TGF-β1和C-Ⅳ的蛋白表達(dá)在低糖培養(yǎng)組也較低，在PBS高糖對照

14、組及Ad/LacZ載體對照組均有所升高，至抗TGF-β中和抗體陽性對照組和Ad/DCN感染組則有明顯下降；MMP-2和MMP-9在低糖培養(yǎng)組相對較高，在PBS高糖對照組及Ad/LacZ載體對照組均有所下降，至抗TGF-β中和抗體陽性對照組和Ad/DCN感染組則有明顯上升。而在處理后72h的腎間質(zhì)細(xì)胞HK-2細(xì)胞中，DCN、TGF-β1和C-Ⅳ蛋白表達(dá)的改變趨勢與RMCs各組相似；MMP-2和MMP-9則在低糖培養(yǎng)組相對較低，在PBS高糖

15、對照組及Ad/LacZ載體對照組均有所升高，至抗TGF-β中和抗體陽性對照組和Ad/DCN感染組則有明顯下降。 結(jié)論:1.高糖促進(jìn)腎小球系膜細(xì)胞和小管細(xì)胞decorin、TGF-β1和C-Ⅳ的蛋白表達(dá)水平升高，而且TGF-β1的升高更為明顯，說明高糖狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)存在TGF-β1過度表達(dá)和decorin相對不足的情況，從而導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的積聚。 2.DCN重組腺病毒載體感染大鼠腎系膜細(xì)胞和小管細(xì)胞后能高效表達(dá)目的蛋白dec