雞艾美耳球蟲純株的建立與DNA條形編碼初探.pdf

1、DNA條形編碼是以線粒體細(xì)胞色素c氧化酶I亞基(CO I)作為一個(gè)統(tǒng)一的目標(biāo)基因進(jìn)行DNA序列分析,以達(dá)到鑒定生物種的目的,是近年米引人注目的一種分子生物學(xué)分類方法.為了初步探討DNA條形編碼在雞艾美耳球蟲(Eimeria)中的應(yīng)用,本研究在通過單卵囊分離感染、生物學(xué)鑒定及特異性引物PCR鑒定建立純株的基礎(chǔ)上,首次對(duì)雞球蟲不同種/株的CO I基因片段進(jìn)行序列分析,并結(jié)合18S rRNA基因,對(duì)雞球蟲分子分類進(jìn)行研究,為雞球蟲分類學(xué)開拓了

2、新思路. 為了保證研究所用蟲種/株為單一蟲種,本研究對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的堆型艾美耳球蟲(Eacervulina)、柔嫩艾美耳球蟲(E tenella)、巨型艾美耳球蟲(E maxima)、變位艾美耳球蟲(E,mivati)、毒害艾美耳球蟲(E,necatrix)、布氏艾美耳球蟲(E,brunette)共6種11株,進(jìn)行了179個(gè)單卵囊分離,每個(gè)卵囊感染1只1～5日齡雛雞,結(jié)果獲得單卵囊分離物42個(gè),單卵囊分離平均成功率為23.46﹪.對(duì)其中1

3、1個(gè)單卵囊分離物進(jìn)行繁殖,按照傳統(tǒng)生物學(xué)鑒定方法選取潛在期、寄生部位、最短孢子化時(shí)間、卵囊形狀、卵囊大小及孢子囊大小等指標(biāo),對(duì)單卵囊分離物進(jìn)行蟲種鑒定,結(jié)果確定為E acervulina 1株、E tenella 2株、E maxima 6株、E mivati 1株、E necatrix 1株.采用針對(duì)Eacervulina、E tenella和E maxima的種特異性引物,分別對(duì)傳代增殖后的11株單卵囊分離株和2株實(shí)驗(yàn)室保存蟲種進(jìn)行

4、PCR擴(kuò)增,以驗(yàn)證生物學(xué)的鑒定結(jié)果和檢測物的蟲種純度,結(jié)果僅在1株單卵囊分離物(E maxima Townsends strain)的繁殖樣品中檢測出被E tenella污染. 為了初步探討CO I基因作為雞球蟲DNA條形編碼的可行性,本研究對(duì)經(jīng)鑒定的10個(gè)單卵囊分離純株和2個(gè)實(shí)驗(yàn)室保存株的CO 1分別進(jìn)行擴(kuò)增,均得到811 bp的片段.多序列比對(duì)結(jié)果顯示同種不同株間均無差異,同源性為100﹪:種間差異較大,其中E tenell

5、a與E necatrix的同源性最高,達(dá)98.4﹪,E maxima與E acervulina的同源性最低,為86.1﹪.分析5個(gè)種兩兩之間的遺傳距離,其中E maxima與E necatrix的遺傳距離最大,為0.171;E tenella與E necatrix的遺傳距離最小,為0.017.分析5條序列組成,A+T平均含量為64.8﹪,明顯高于G+C含量.進(jìn)化樹顯示在5種球蟲間,E tenella和E necatrix親緣關(guān)系最近,二

6、者形成一個(gè)獨(dú)立的分枝,與Eacervulina、Emivati和Emaxima共同聚為一大類,能與其他4個(gè)屬的原蟲明顯區(qū)分開. 為了進(jìn)一步驗(yàn)證mtCO I基因用于雞球蟲分類的準(zhǔn)確性,本研究利用常用的18S rRNA基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析.對(duì)3種球蟲8個(gè)蟲株的18S rRNA基因分別進(jìn)行擴(kuò)增,獲得長度為1746～1756bp基因.經(jīng)多序列比對(duì),結(jié)果顯示同種不同株間的同源性大于不同種問的同源性,其中3個(gè)Emaxima株問同源性在98.

7、7﹪～99.3﹪之間,4個(gè)E-tenella株間同源性在99.7﹪～99.9﹪之間,三個(gè)不同的種間同源性為96.5﹪～98.1﹪.計(jì)算8個(gè)株兩兩之間的遺傳距離,3個(gè)種中E maxima與Etenella的遺傳距離最大,為0.038:E maxima與E acervulina的遺傳距離最小,為0.021.3個(gè)E maxima聚為一支,與E. brunetti、E. mitis、E. mivati、E. praecox和E. acervul