人血管生成素相關(guān)生長因子的克隆、表達及其傷口愈合相關(guān)生物學功能的研究.pdf

1、從20世紀80年代開始，生長因子在皮膚傷口愈合過程中的重要作用逐漸被人們所認識。傷口局部應用某些外源性生長因子可以明顯提高皮膚的自我修復能力，與傳統(tǒng)的治療方法相結(jié)合，能有效地提升治療的效果并且縮短治療的周期。目前已有50多種生長因子相繼被發(fā)現(xiàn)，它們分別歸屬于五大家族：表皮生長因子(EGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-beta)、血小板源性生長因子(PDGF)和血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)家族。 血

2、管生成素相關(guān)生長因子(AGF)是血管生成素相關(guān)蛋白家族(ARPs)的新成員，其轉(zhuǎn)基因小鼠皮膚潮紅，耳朵、口唇部位充血，組織學特征表現(xiàn)為皮膚真皮層微血管大量增生，表皮層異常增厚。與正常小鼠比較，這種小鼠皮膚傷口的愈合速度明顯加快。籍此，AGF被認為是一種新的能夠促進皮膚傷口愈合的生長因子，具有潛在的開發(fā)和應用價值。但是，至今對其傷口愈合相關(guān)生物學功能的認識仍然停留在轉(zhuǎn)基因動物水平，缺乏直接基于蛋白的系統(tǒng)研究。本論文在純化的重組蛋白的基礎上

3、，以主要的三種傷口愈合相關(guān)細胞——表皮角質(zhì)形成細胞、真皮成纖維細胞和血管內(nèi)皮細胞為研究對象，對人AGF促進傷口愈合可能的細胞學機制進行了系統(tǒng)的研究。 按研究進程，我們將本論文分成四章敘述。在第一章中，我們用序列分析軟件和公共生物學數(shù)據(jù)庫對人AGF及其基因序列進行了系統(tǒng)的解析，目的是了解基因和蛋白的結(jié)構(gòu)特點，為相關(guān)的生物學功能研究提供線索和依據(jù)。人AGF編碼序列全長1413bp，平均GC含量達到64％，對應的蛋白多肽鏈由470個

4、氨基酸(aminoacid，aa)組成，其中1-20aa為信號肽，21-470aa為成熟蛋白，理論分子量為50KD。同其它血管生成素相關(guān)蛋白家族成員類似，人AGF蛋白N端包含兩個螺旋卷曲結(jié)構(gòu)域(Coiled-coil domain：57-119、136-174aa)和一個纖維蛋白樣結(jié)構(gòu)域(Fibrinogen-like domain：258-468aa)。人AGF序列中還包括2處潛在的N糖基化位點和4處0糖基化位點，以及7個家族保守的半

5、胱氨酸(分別位于第27、43、185、260、287、410和423位殘基)，這些信息提示人AGF可能是一種糖蛋白，分子中有形成鏈內(nèi)和/或鏈間多對二硫鍵的可能，而鏈間的二硫鍵可使蛋白在自然狀態(tài)下以聚體形式存在。從進化樹和序列相似性上分析，人AGF與同一家族中ARP1和ARP2的同源性最高，分別達到40.7％和43.2％，而與另兩個成員，ARP3和ARP4，僅有20.2％、21.1％的同源性。我們用UniGene數(shù)據(jù)庫對人和小鼠AGF的組

6、織表達譜進行了分析，發(fā)現(xiàn)人AGF僅在腦、血小板和小腸中呈現(xiàn)微弱的表達，而小鼠AGF則在小腦、肝、胰、肺、脾、膀胱、皮膚、內(nèi)分泌腺和胚胎等多個組織中都有一定程度的表達。最后，我們用Prosite數(shù)據(jù)庫對人AGF的序列模體進行了全面的分析，結(jié)果顯示人AGF含有以下多種序列模體：13處肉豆蔻酰化位點、6處蛋白激酶C磷酸化位點、2處N-糖基化位點、1處cAMP和cGMP依賴性磷酸化位點、3處酪蛋白激酶H磷酸化位點、1處酪氨酸硫酸化位點、1處RG

7、D細胞粘附序列和1處酪氨酸激酶磷酸化位點。其中，RGD序列存在于多種細胞外基質(zhì)蛋白序列中，通過與細胞表面特定的整合素分子結(jié)合介導傷口愈合相關(guān)細胞的粘附、移行、增殖等功能，在正常的傷口愈合過程中起著十分重要的作用。進一步的序列聯(lián)配結(jié)果表明，在人血管生成素和血管生成素相關(guān)蛋白家族中，唯人AGF序列含有此RGD序列，并且它在不同的哺乳動物(人、小鼠、大鼠、狗)間保守。這一發(fā)現(xiàn)提示AGF參與傷口愈合的機制可能和RGD序列有關(guān)。 在第二

8、章中，我們克隆了人AGF基因，并在哺乳動物細胞中實現(xiàn)了重組蛋白的表達和純化。我們從人基因組上擴增了人AGF編碼序列的1-526bp片段，從肝cDNA文庫中擴增了513-1413bp片段，兩片段經(jīng)PCR融合合成了全長的人AGF編碼序列。為了在哺乳動物細胞中實現(xiàn)高分泌表達，我們用強信號肽(大鼠血清白蛋白信號肽，RSAL)序列取代了人AGF自身的信號肽序列，為了方便后續(xù)的純化工作又在異源信號肽前面融合了6xHis標簽，最后將完整的表達序列克隆

9、入pcDNA3載體構(gòu)建成真核表達質(zhì)粒pcDNA3/RSAL-His-hAgf。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NIH/3T3細胞，經(jīng)G418(750μg/ml)篩選18天形成單克隆，挑選15個克隆比較分泌表達量(Dot blot半定量法)，選擇產(chǎn)量最高的克隆用于放大規(guī)模培養(yǎng)?；旌蟽膳置谂囵B(yǎng)液(約1升)，加固體硫酸銨至85％使目的蛋白沉淀，用緩沖液溶解后直接上鎳柱純化，最后得到1.8ml濃度約為420μg/ml的重組人AGF蛋白，純度達到90％。通過還原和非還

10、原SDS-PAGE膠電泳結(jié)果判斷，在天然狀態(tài)下，人AGF至少以四聚體形式存在，單體的實際分子量約為66KD，明顯大于理論值50KD。 在第三章中，我們研究了重組人AGF調(diào)節(jié)傷口愈合相關(guān)細胞(表皮角質(zhì)形成細胞、真皮成纖維細胞和血管內(nèi)皮細胞)增殖、粘附和移行的功能。MTT細胞增殖實驗的結(jié)果顯示，重組人AGF僅在高濃度時(濃度達到μg／ml)時表現(xiàn)出促進 皮膚角質(zhì)細胞(HaCaT)增殖的功能，對成纖維細胞(NIH／3T3)和血管內(nèi)皮細胞

11、 (PIEC)都無刺激增殖作用。但是，體外的粘附實驗證實包被在固相載體表面的 人AGF能有效地支持角質(zhì)形成細胞(HaCaT)、成纖維細胞(NIH／3T3)和血管內(nèi)皮細胞(PIEC)的粘附和伸展，而且這種作用呈現(xiàn)明顯的劑量一效應關(guān)系。人AGF對三種細胞的粘附曲線相似，當濃度為2—3μg／ml時，粘附達到最高值，隨著蛋白濃度的繼續(xù)增加，粘附進入并維持在平臺期。觀察細胞的形態(tài)和伸展情況發(fā)現(xiàn)，當細胞與固相的人AGF接觸約20-30分鐘后，細

12、胞發(fā)生粘附并開始伸展，三種細胞在2小時內(nèi)都能實現(xiàn)完全的伸展。進一步的粘附抑制實驗顯示，人AGF對HaCaT,NIH／3T3和PIEC的粘附作用可被線性多肽RGDS(競爭性結(jié)合細胞表面的RGD結(jié)合整合素)和環(huán)行多肽GPenGRGDSPCA(競爭性結(jié)合 RGD結(jié)合整合素中的α<,v>整合素)抑制，而且這種抑制作用隨著多肽濃度的增高而增強。對HaCaT,NIH／3T3和PIEC三種細胞，RGDS分別在200μM、250μM和700μM濃度時實

13、現(xiàn)50％粘附抑制率，GPenGRGDSPCA則在8μM、25μM和100μM濃度時實現(xiàn)50％粘 附抑制率。兩者相比，達到相同的抑制率，GPenGRGDSPCA的濃度僅為RGDS的1／25、1／10和1／7，約為一個數(shù)量級的差異。這些結(jié)果表明，人AGF對角質(zhì)形成細胞、成纖維細胞和內(nèi)皮細胞的粘附作用是由細胞表面的RGD結(jié)合整合素介導的，而且最有可能是其中的α<,v>整合素。接著，通過Transwell細胞移行實驗我們發(fā)現(xiàn)，人AGF對角質(zhì)形

14、成細胞(HaCaT)、成纖維細胞(NIH／3T3)和血管內(nèi)皮細胞(PIEC)都有劑量依賴的化學趨化作用，可引起細胞的定向移行。移行抑制實驗顯示，人AGF(4μg／ml)對三種細胞的趨化作用都可以被200μM GPenGRGDSPCA環(huán)肽抑制：HaCaT細胞移行被抑制了62％；NIH／3T3細胞移行被抑制了68％；PIEC細胞移行被抑制了52％，而對照線形短肽RFDS未能產(chǎn)生抑制效果。這些結(jié)果表明，角質(zhì)形成細胞、成纖維細胞和內(nèi)皮細胞表面的

15、RGD結(jié)合整合素(最有可能是其中的α<,v>整合素)介導了人AGF誘導的趨化移行作用。 在第四章中，我們建立了皮膚創(chuàng)傷小鼠動物模型，并利用此模型對外用重組人AGF能否促進皮膚傷口愈合進行了研究。我們選用昆明種小鼠，在其下背部制造兩個對稱的圓形傷口(直徑約0.8cm)，對照側(cè)涂抹林可霉素利多卡因凝膠(商品化凝膠制劑)，用藥側(cè)涂抹摻入人AGF(2μg／ml)的林可霉素利多卡因凝膠，兩個傷口每天各涂抹一次，連續(xù)五天。三天后，用藥側(cè)傷

16、口發(fā)生明顯的收縮，傷口直徑小于對照側(cè)。五天后，傷口直徑的差別達到最大，用藥側(cè)傷口顯著地小于對照側(cè)傷口。之后，兩者的差別不再擴大，到第十天時，對照側(cè)傷口也完成了良好的收縮和閉合，其直徑與用藥側(cè)不再有明顯的差別。選第五天時兩側(cè)傷口差異最顯著的一只小鼠引頸處死，取對照側(cè)和用藥側(cè)傷口全層皮膚做組織切片和HE染色。結(jié)果顯示，用藥側(cè)表皮層細胞增生、移行速度加快，再上皮化進程明顯優(yōu)于對照側(cè)。本章動物實驗的結(jié)果表明，外用重組的人AGF能夠有效地促進皮膚