抑制瞬時(shí)受體電位M7通道表達(dá)對(duì)人牙髓干細(xì)胞增殖、遷移及成骨-成牙向分化的影響.pdf

1、背景和目的：
　　 干細(xì)胞是一類未充分分化，具有自我更新能力的多潛能細(xì)胞，在一定條件下，可以分化成多種功能細(xì)胞，具有再生各種組織器官的潛能。2000年Gronthos等用酶消化法首次從健康人第三磨牙中分離出具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞群體并命名為人牙髓干細(xì)胞，目前證實(shí)人牙髓干細(xì)胞在體內(nèi)體外均可誘導(dǎo)分化為牙髓牙本質(zhì)樣復(fù)合體，這為牙組織再生提供了重要的細(xì)胞來源。深入了解牙髓干細(xì)胞生理功能調(diào)節(jié)機(jī)制對(duì)于牙組織再生有重要意義。
　　 瞬時(shí)

2、受體電位通道M7(transient receptor potential melastatin7，TRPM7)屬于瞬時(shí)受體電位超家族中黑色素抑制類亞家族的一員，由離子通道和激酶聯(lián)合組成。該通道廣泛組成性存在于機(jī)體組織和細(xì)胞，目前被認(rèn)為是在細(xì)胞水平上調(diào)控鎂離子平衡的主要通道。研究發(fā)現(xiàn)TRPM7通道與細(xì)胞的一系列生理功能密切相關(guān)，包括細(xì)胞存活、增殖、遷移、分化、胚胎器官發(fā)育等。鈣鎂離子和細(xì)胞增殖、遷移、分化過程密切相關(guān)，TRPM7作為調(diào)控

3、細(xì)胞水平鈣鎂離子平衡的重要通道，目前尚未有研究報(bào)道關(guān)于TRPM7在人牙髓干細(xì)胞的表達(dá)及功能研究，鑒于TRPM7對(duì)細(xì)胞執(zhí)行生理功能的重要性，本研究旨在探討TRPM7對(duì)人牙髓干細(xì)胞增殖、遷移、分化的作用。
　　 本論文主要包括以下四章內(nèi)容:
　　 第一章、人牙髓干細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定本章實(shí)驗(yàn)利用改良組織塊酶消化法分離培養(yǎng)人牙髓干細(xì)胞，有限稀釋法純化人牙髓干細(xì)胞;流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面分子標(biāo)記物;檢測(cè)細(xì)胞克隆形成能力和多向分化

4、潛能。
　　 第二章、TRPM7在人牙髓干細(xì)胞及牙髓組織表達(dá)與定位RT-PCR在mRNA水平檢測(cè)TRPM6和TRPM7在人牙髓干細(xì)胞的表達(dá);Western blot在蛋白水平檢測(cè)TRPM7在人牙髓干細(xì)胞的表達(dá);細(xì)胞間接免疫熒光檢測(cè)TRPM7在人牙髓干細(xì)胞的表達(dá)位置;組織免疫熒光檢測(cè)TRPM7在人牙髓組織的表達(dá)情況。
　　 第三章、抑制TRPM7表達(dá)對(duì)人牙髓干細(xì)胞增殖、遷移能力的影響通過Realtime PCR、Weste

5、rn blot驗(yàn)證TRPM7 shRNA慢病毒的抑制效果;MTT檢測(cè)TRPM7非特異抑制劑2-APB對(duì)人牙髓干細(xì)胞增殖能力的影響(50μM、100μM2-APB);MTT檢測(cè)慢病毒特異抑制TRPM7表達(dá)對(duì)人牙髓干細(xì)胞增殖能力的影響;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)慢病毒特異抑制TRPM7表達(dá)對(duì)人牙髓干細(xì)胞細(xì)胞周期分布的影響;Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)慢病毒特異抑制TRPM7表達(dá)對(duì)人牙髓干細(xì)胞遷移能力影響。
　　 第四章、抑制TRPM7表達(dá)對(duì)人牙髓

6、干細(xì)胞成骨/成牙向分化的影響Realtime PCR檢測(cè)礦化過程中TRPM7 mRNA表達(dá)變化;Realtime PCR檢測(cè)TRPM7 shRNA組和Scrambled shRNA組礦化誘導(dǎo)21 d后礦化相關(guān)基因ALP、DSPP、BSP、OSX、RUNX2 mRNA表達(dá)情況。
　　 材料與方法：
　　 人牙髓干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及純化人牙髓干細(xì)胞來源于南方醫(yī)院口腔醫(yī)院頜面外科門診18-25歲患者因正畸治療或阻生需要拔除的完

7、整、健康的第三磨牙（經(jīng)患者知情同意）。改良組織塊酶消化法分離培養(yǎng)人牙髓干細(xì)胞。牙齒拔除后置含雙倍雙抗的DMEM培養(yǎng)液內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室，選用渦輪機(jī)牙鉆在釉牙骨質(zhì)界環(huán)繞牙頸部磨出一定深度的溝槽后（注意不能穿髓），在超凈臺(tái)內(nèi)將牙齒沿溝槽劈開，無菌條件下取出牙髓（去除根尖孔端約2mm的牙髓），置PBS緩沖液內(nèi)反復(fù)漂洗至少3次。用眼科剪將牙髓組織剪碎為大小為1 mm×1 mm×1 mm的組織塊，4 g/L膠原酶37℃消化10 min，使組織松散即終止消

8、化，800 rpm離心10 min，棄上清，加入少量培養(yǎng)液，輕輕吹打，使細(xì)胞懸液與松散組織呈混勻狀態(tài)，然后移至6孔板內(nèi)鋪平，并加蓋玻片壓于組織之上，補(bǔ)充液體至適量。每隔3d換液一次。待細(xì)胞生長(zhǎng)匯合至80％傳代培養(yǎng)。利用有限稀釋法純化人牙髓干細(xì)胞，將改良組織塊酶消化法分離培養(yǎng)的人牙髓干細(xì)胞以1～2個(gè)/孔密度接種96孔板，常規(guī)培養(yǎng)7-14 d后，待出現(xiàn)細(xì)胞克隆后（＞50個(gè)細(xì)胞/克?。U(kuò)大培養(yǎng)。
　　 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記物取第

9、3代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，將其密度調(diào)至以1×106/ml后，細(xì)胞重懸于預(yù)冷的PBS中。用小鼠抗人PE標(biāo)記的CD29、CD34、CD45、CD90;小鼠抗人FITC標(biāo)記的CD44、CD105抗體冰上避光敷育1h。預(yù)冷的PBS清洗2次，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
　　 多向分化能力檢測(cè)取第3代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以5×104個(gè)/35mm培養(yǎng)皿密度接種，待細(xì)胞生長(zhǎng)匯合至70％時(shí)，分別加入成骨、成脂、成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)21d，分別使用茜素紅、油

10、紅O、阿利新藍(lán)染色，倒置顯微鏡下觀察。
　　 Realtime PCR抽提細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，采用SYBR Green法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以GADPH為內(nèi)參基因，通過相對(duì)定量以2-△△Ct值代表基因的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度。
　　 Western blot抽提細(xì)胞總蛋白，采用BCA法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定，SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、免疫雜交、顯影。
　　 細(xì)胞免疫熒光
　　 以1×104個(gè)/孔細(xì)胞密度接種

11、48孔板，待細(xì)胞貼壁后，4％多聚甲醛固定30min，0.25％ Triton X-100穿孔10 min，5％BSA室溫封閉30 min。山羊抗人一抗TRPM7(1∶100)4℃孵育過夜，PBS洗滌3次;Cy3標(biāo)記的小鼠抗山羊二抗(1∶1000)37℃孵育1h，PBS洗3次;DAPI復(fù)染，PBS洗3次;熒光顯微鏡觀察、拍照。
　　 組織免疫熒光
　　 石蠟切片二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，雙氧水滅活過氧化物酶;5％BSA室溫

12、封閉30 min;山羊抗人一抗TRPM7(1∶100)4℃過夜孵育，PBS洗3次;FITC標(biāo)記的兔抗山羊二抗(1∶500)室溫避光孵育1h，PBS洗3次;、拍照。
　　 慢病毒載體構(gòu)建及細(xì)胞感染抑制TRPM7的靶點(diǎn)序列參照文獻(xiàn)，陰性對(duì)照的靶點(diǎn)序列和人類基因沒有任何相關(guān)性;慢病毒表達(dá)載體為GV118-GFP，包裝細(xì)胞為HEK293T細(xì)胞，由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司構(gòu)建包裝。靶點(diǎn)序列克隆到表達(dá)載體上后與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞

13、，收集濃縮病毒，測(cè)定病毒滴度。將慢病毒懸液按熒光顯微鏡觀察照不同感染復(fù)數(shù)感染正常人牙髓干細(xì)胞，72 h后倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)發(fā)光情況，篩選合適的感染復(fù)數(shù)。
　　 MTT實(shí)驗(yàn)
　　 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人牙髓干細(xì)胞以2×103/孔的密度接種96孔板。到達(dá)時(shí)間監(jiān)測(cè)點(diǎn)時(shí)加入20μl MTT，37℃避光孵育4h;吸去上清培養(yǎng)液終止培養(yǎng)，每孔加入200μl DMS

14、O，充分振蕩溶解結(jié)晶;在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定490 nm波長(zhǎng)下各孔OD值。
　　 細(xì)胞周期分析
　　 胰酶消化Scrambled shRNA組和TRPM7 shRNA組細(xì)胞，離心收集細(xì)胞，用預(yù)冷PBS洗細(xì)胞兩次。加入預(yù)冷70％乙醇于-20℃固48 h。染色前用PBS洗去固定液，加入100μlRNaseA37℃水浴30 min，加入400μl PI染色混勻，4℃避光30 min。流式細(xì)胞儀檢測(cè)，記錄激發(fā)波長(zhǎng)488 nm處紅

15、色熒光。
　　 Transwell實(shí)驗(yàn)Scrambled shRNA組和TRPM7 shRNA組人牙髓干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，使細(xì)胞周期同步化;上室加入5×104個(gè)細(xì)胞，使用無血清培養(yǎng)基;下室加入含10％ FBS培養(yǎng)基，37℃、5％CO2培養(yǎng)24 h，甲醇固定，0.1％結(jié)晶紫染色，倒置顯微鏡下觀察并進(jìn)行分區(qū)細(xì)胞計(jì)數(shù)。
　　 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以(x)±s表示，兩

16、獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.人牙髓干細(xì)胞細(xì)胞表型及生物學(xué)特性本實(shí)驗(yàn)利用改良組織塊酶消化法分離培養(yǎng)人牙髓干細(xì)胞，所獲細(xì)胞具有克隆形成能力;流式細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記物CD29、CD44、CD90、CD105(間充質(zhì)干細(xì)胞分子標(biāo)志物)陽性表達(dá)率分別為97.77％、99.09％、99.12％、79.15％，CD34、CD45（造血干細(xì)胞分子標(biāo)志物）陽性表達(dá)率為分別0.0

17、7％、0.19％;細(xì)胞具有多向分化潛能，能向成骨、成脂、成軟骨方向分化。
　　 2.TRPM7在人牙髓干細(xì)胞表達(dá)情況RT-PCR顯示TRPM6、TRPM7 mRNA在人牙髓干細(xì)胞表達(dá);Western blot顯示TRPM7蛋白在人牙髓干細(xì)胞表達(dá);細(xì)胞免疫熒光顯示TRPM7主要表達(dá)于人牙髓干細(xì)胞的胞膜與胞漿;組織免疫熒光結(jié)果顯示TRPM7廣泛表達(dá)于牙髓組織。
　　 3.抑制TRPM7表達(dá)對(duì)人牙髓干細(xì)胞增殖、遷移的影響本實(shí)驗(yàn)

18、通過Realtime PCR、Western blot驗(yàn)證成功構(gòu)建TRPM7 shRNA慢病毒載體;TRPM7非特異抑制劑2-APB可以明顯抑制人牙髓干細(xì)胞增殖，并且存在一定濃度依賴性;慢病毒特異抑制TRPM7表達(dá)后可抑制人牙髓干細(xì)胞增殖和遷移能力。
　　 4.抑制TRPM7表達(dá)對(duì)人牙髓干細(xì)胞成骨/成牙向分化的影響礦化過程中人牙髓干細(xì)胞TRPM7 mRNA表達(dá)量明顯升高，TRPM7 shRNA組礦化誘導(dǎo)21 d后ALP、DSPP

19、、BSP、OSX、RUNX2 mRNA表達(dá)量較ScrambledshRNA組明顯降低。說明抑制TRPM7表達(dá)可干擾人牙髓干細(xì)胞成骨/成牙向分化。
　　 結(jié)論：
　　 本實(shí)驗(yàn)分離培養(yǎng)的人牙髓干細(xì)胞來源于間充質(zhì)組織，具有克隆形成能力和成骨、成脂、成軟骨多向分化潛能。
　　 人牙髓干細(xì)胞表達(dá)TRPM6和TRPM7; TRPM7主要表達(dá)于人牙髓干細(xì)胞胞膜和胞漿;TRPM7在人牙髓組織廣泛表達(dá)。
　　 TRPM7對(duì)