人博卡病毒結構蛋白與非結構蛋白功能的初步研究.pdf

1、2005年科學家Allander利用PCR技術，通過借助信息學相關方法對嬰幼兒鼻咽分泌物樣本進行大范圍排查，發(fā)現了一類新型細小病毒，即人博卡病毒(HumanBocavirus，HBoV)。HBoV是一種直徑約為18-25nm，無囊膜，單鏈線性DNA病毒，基因組大小約為5300 nt，其外包被著T=1的二十面體的蛋白衣殼，以保護DNA不受外界環(huán)境如高溫、PH變化、高鹽等影響。感染HBoV的患者外表癥狀多為發(fā)燒、咳嗽、喘息等下呼吸道感染癥狀

2、，少數病情嚴重者出現呼吸窘迫的現象。HBoV屬于細小病毒科，細小病毒亞科，博卡病毒屬。
　　 HBoV基因組含有兩個主要開放閱讀框，一個編碼非結構蛋白NS1和NP1，另一個則轉錄翻譯兩個衣殼蛋白VP1和VP2；VP1的5’端獨特區(qū)VP1-Unique序列具有磷脂酶A2活性，這種活性與病毒的感染性有關，已有的一些資料表明，基因組中編碼非結構蛋白的區(qū)域比較保守，而變化的部分位于編碼核衣殼蛋白的區(qū)域；在基因組DNA的3’端和5’端分別

3、存在一個末端反向重復序列(Invertedterminal repeat，ITR)，其會形成反轉回文結構，細小病毒DNA復制時是以該末端兩部分反轉互補的回折部分作為的引物。
　　 本研究依據人博卡病毒基因序列(GeneBank：GU139423)設計VP1抗原表位區(qū)域(4160-4480 nt)的引物，通過PCR技術擴增目的基因，并將擴增的片段插入到質粒pET-49b(+)中，通過IPTG誘導融合蛋白，并用切膠純化的方法切取融合

4、蛋白，研磨并用PBS溶解，之后將制備的融合蛋白樣免疫小鼠，最終得到VP1多克隆抗體，為今后研究人博卡病毒結構蛋白VP1和VP2的功能奠定了堅實的基礎。
　　 同時，為了弄清楚人博卡病毒VP1、VP2以及NS1蛋白在細胞中的分布情況，本實驗還將這幾個蛋白的基因分別克隆到真核表達載體pEGFP系列上，并將重組質粒轉入哺乳動物細胞293T細胞中，觀察VP1、VP2以及NS1蛋白在細胞中的定位分布。然而，在研究蛋白定位的同時，本實驗發(fā)現