中國(guó)大鯢種質(zhì)資源保護(hù)的分子遺傳學(xué)研究.pdf

1、中國(guó)大鯢是我國(guó)特有的珍稀物種，為水生魚(yú)類演化到陸生爬行類的過(guò)渡類型。由于人為過(guò)度捕殺，生境破壞，以及自身繁殖率低等因素，造成其自然種群數(shù)量銳減，并處于極度瀕危狀態(tài)，已被我國(guó)列為國(guó)家二級(jí)保護(hù)動(dòng)物。為恢復(fù)中國(guó)大鯢資源，目前已廣泛開(kāi)展人工養(yǎng)殖，但由于親本過(guò)少，養(yǎng)殖模式不合理，容易引起近交衰退。本研究通過(guò)cDNA文庫(kù)構(gòu)建和篩選、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA（RAPD），擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)（AFLP）、線粒體DNA（mtDNA）序列分析等技術(shù)，從種質(zhì)資源保存

2、和評(píng)價(jià)兩個(gè)層面進(jìn)行中國(guó)大鯢種質(zhì)資源保護(hù)研究。通過(guò)保存中國(guó)大鯢種群遺傳信息，評(píng)價(jià)自然種群及養(yǎng)殖群體的種質(zhì)狀況，為中國(guó)大鯢資源的保護(hù)和可持續(xù)利用提供科學(xué)依據(jù)。主要研究結(jié)果如下： 1.中國(guó)大鯢腦組織cDNA文庫(kù)構(gòu)建。 本文以中國(guó)大鯢腦組織為材料，提取總RNA，應(yīng)用CloneminerTM文庫(kù)構(gòu)建技術(shù)構(gòu)建了cDNA文庫(kù)。經(jīng)檢測(cè)，文庫(kù)初始滴度為5×105 cfu/mL，重組率為91.70％，插入片斷大小在0.35～3.9 kb，平

3、均插入片段大小為0.791 kb，文庫(kù)擴(kuò)增后滴度為4.0×109 cfu/mL。隨機(jī)挑選200個(gè)陽(yáng)性克隆測(cè)序，經(jīng)生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)20個(gè)片段與已報(bào)道的基因有較高同源性，包括促甲狀腺激素基因、生長(zhǎng)激素（Growth hormone，GH）基因及催乳素（Prolactin，PRL）基因等。 2.GH和PRL組織分布及系統(tǒng)發(fā)育應(yīng)用分析。 采用半定量RT—PCR方法分析了GH和PRL基因在成體中國(guó)大鯢各組織中的mRNA表達(dá)情況

4、，結(jié)果表明：GH，PRL只在垂體中檢測(cè)到表達(dá)；這與其他魚(yú)類和哺乳類的研究結(jié)果相一致?；贕H和PRL cDNA序列與氨基酸序列構(gòu)建的兩棲類系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)能夠反映中度遠(yuǎn)源的兩棲類真實(shí)發(fā)育關(guān)系。該基因家族的兩個(gè)基因可以得到較為一致的樹(shù)型，具有相近的系統(tǒng)發(fā)育分析能力。對(duì)功能基因數(shù)據(jù)源的進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)，核苷酸編碼區(qū)前兩個(gè)密碼子序列與氨基酸序列在解決較遠(yuǎn)的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系時(shí)均具有相似價(jià)值，但是在MP法分析時(shí)，核苷酸序列略微優(yōu)于氨基酸序列。GH在解決有尾目

5、分類時(shí)，NJ樹(shù)與MP樹(shù)結(jié)果與傳統(tǒng)的有尾目分類關(guān)系一致。 3.采用AFLP標(biāo)記及線粒體控制區(qū)序列分析方法對(duì)中國(guó)大鯢野生種群的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。 AFLP標(biāo)記被用于檢測(cè)5個(gè)自然種群的遺傳多樣性。采用9對(duì)引物組合對(duì)60個(gè)個(gè)體共擴(kuò)增出501條帶，其中多態(tài)性條帶354（69.82％）；中國(guó)大鯢高水平的遺傳多樣性符合其生活史特征及地理分布，顯示作為一種古老物種的強(qiáng)大的潛在適應(yīng)力。AMOVA分析表明中國(guó)大鯢遺傳多樣性絕大

6、部分位于種群內(nèi)（97.94％）。種群間遺傳分化較弱（Fst類似物θ=0.1368；φst=0.021，P<0.001）。種群間遺傳距離（φst）和地理距離不相關(guān)（所有群體：r=0.1887，P=0.3150；長(zhǎng)江流域群體：r=0.5336，P=0.3320）。聚類結(jié)果基本依照長(zhǎng)江流域、黃河流域分為兩支?；趥€(gè)體距離的聚類結(jié)果顯示，多數(shù)黃河流域個(gè)體與長(zhǎng)江流域個(gè)體聚為一支，存在一定的混亂。對(duì)8個(gè)種群15個(gè)個(gè)體線粒體控制區(qū)序列進(jìn)行分析，在78

7、9 bp長(zhǎng)的片段中共得到25個(gè)變異位點(diǎn)，定義10個(gè)單倍型。單倍型多態(tài)性和核苷酸多態(tài)性分別為0.895和0.960％，顯示控制區(qū)可以揭示中國(guó)大鯢豐富的遺傳多樣性水平。各單倍型間Kimura-2-parameter距離在0.001～0.022之間，平均為0.014，顯示分化較小。聚類結(jié)果大致可以分為黃河流域種群、長(zhǎng)江流域種群及珠江流域種群，體現(xiàn)了與地理分布格局的統(tǒng)一性。但仍有個(gè)別個(gè)體聚類混亂。可能由于長(zhǎng)期存在人為因素的干擾所致。結(jié)合遺傳結(jié)構(gòu)

8、結(jié)果及化石證據(jù)，推測(cè)中國(guó)大鯢種群的擴(kuò)散途徑為由北至南。此外還將中國(guó)大鯢與近緣物種以及進(jìn)化歷程相近的物種的遺傳多樣性進(jìn)行比較，以期進(jìn)一步闡明中國(guó)大鯢遺傳背景，為保護(hù)和利用這一珍稀古老物種的種質(zhì)資源提供理論依據(jù)。針對(duì)目前中國(guó)大鯢遺傳背景及保護(hù)現(xiàn)狀，對(duì)中國(guó)大鯢野生種群資源的保護(hù)提出建議。 4.利用隨機(jī)引物擴(kuò)增多態(tài)DNA（RAPD）及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP）標(biāo)記對(duì)中國(guó)大鯢人工養(yǎng)殖四個(gè)世代群體進(jìn)行了遺傳多樣性檢測(cè)。 本研究R

9、APD分析使用了20條隨機(jī)引物，共擴(kuò)增出91個(gè)位點(diǎn)，多態(tài)位點(diǎn)比例為親代46.15％、子一代42.86％、子二代39.56％，子三代16.48％。中國(guó)大鯢世代群體的香農(nóng)信息指數(shù)（0.2787±0.0330、0.2556±0.0319、0.2301±0.0309、0.0644±0.0164）和基因多樣性指數(shù)（0.1935±0.0234、0.1759±0.0223、0.1573±0.0215、0.0401±0.0107）均呈逐代下降之勢(shì)，進(jìn)一

10、步ANOVA分析顯示中國(guó)大鯢在繁育至子二代時(shí)差異并不顯著，到子三代時(shí)達(dá)到極顯著水平。AFLP方法使用九對(duì)引物組合，在中國(guó)大鯢四個(gè)世代群體60個(gè)樣品中共得到490個(gè)位點(diǎn)，其中多態(tài)位點(diǎn)數(shù)為291個(gè)，多態(tài)比例為59.39％。而中國(guó)大鯢親代、子一代、子二代和子三代群體多態(tài)位點(diǎn)比例分別為48.16％、44.69％、44.08％和32.24％，呈遞減趨勢(shì)。香農(nóng)信息指數(shù)（0.2775±0.0134、0.2539±0.0132、0.2481±0.013