TGFβ-,2-抗體抑制晶狀體上皮細胞轉分化研究.pdf

1、目的：①觀察TGFβ2和TGFβ2抗體作用于體外培養(yǎng)的人晶狀體上皮細胞(hLEC)后，對細胞增殖、轉分化特異性標記物αSMA和FN mRNA表達、信號通路轉導蛋白Smad4動態(tài)表達的影響。②測定兔眼晶狀體前囊膜片囊袋內再植入術后各時間點房水中總量和活性TGFβ2濃度，觀察其波動規(guī)律。③活體觀察TGFβ2和TGFβ2抗體作用于兔眼晶狀體前囊膜片囊袋內再植入術后各時間點轉分化特異性標記物αSMA和FN mRNA表達的差異。探索TGFβ2抗體

2、影響LEC轉分化的效果和機制。 方法：⑴體外培養(yǎng)的hLEC中分別添加A組10ng/ml hTGFβ2，B組0.3μg/mlTGFβ2抗體，C組10ng/ml hTGFβ2+0.3μg/mlTGFβ2抗體，對照組0.9％生理鹽水。MTT法測定對細胞增殖的影響、RT-PCR方法測定8，16，24和48h各時點αSMA和FN mRNA的表達，Western blot方法觀察2，8，16和24h各時點Smad4蛋白的表達。⑵20只新西蘭

3、白兔，一眼行晶狀體超聲乳化聯合前囊膜片囊袋內再植入術，另一眼為對照。術后1，3，7，14和28d抽取術眼和對照眼房水樣本，ELISA法測定總量和活性TGFβ2濃度。⑶在兔眼晶狀體超聲乳化聯合前囊膜片囊袋內再植入術后3天囊袋內注射A組10ng/mlhTGFβ2，B組0.3μg/mlTGFβ2抗體，C組10ng/mlhTGFβ2+0.3μg/mlTGFβ2抗體，對照組平衡鹽溶液各100μl，RT-PCR和實時熒光定量PCR方法測定術后5、1

4、0、15d囊袋組織樣本中轉分化標志物αSMA和FN mRNA的表達量，病理組織切片HE染色法和免疫組織化學法觀察LEC、αSMA和FN蛋白的分布。 結果：①hLEC體外培養(yǎng)添加了TGFβ2和TGFβ2抗體后，MTT法檢測A組(0.154±0.006) hLEC增殖受到抑制，與對照組(0.191±0.008)相比存在統計學顯著差異(P<0.05)；B組(0.203±0.014)和C組(0.202±0.008) hLEC增殖未受到抑

5、制，與對照組(0.191±0.008)相比無統計學顯著差異(P>0.05)。RT-PCR法檢測A組8h即可出現αSMA和FN mRNA表達并持續(xù)至48h，B組和對照組48h出現αSMA和FN mRNA表達陽性，C組24h和48h出現αSMA和FN mRNA表達陽性。Western blot法檢測A組各時間點均可檢測到Smad4蛋白，2h有表達(1.51g/L)，16h達到峰值(3.15g/L)。對照組、B組和C組在2h和8h Smad4

6、蛋白相對含量較低。②ELISA法測定兔眼術后房水樣本發(fā)現術后1d房水中總量TGFβ2濃度升高，維持較高水平超過術后28d；活性TGFβ2濃度術后1、3d下降，術后7d恢復至術前水平。③RT-PCR法檢測，各組術后5d即可出現αSMA表達陽性，持續(xù)至術后15d。A組術后5d出現FN mRNA表達，持續(xù)至術后15d，B組、C組和對照組術后10和15d出現FN mRNA表達陽性。實時熒光定量PCR檢測，術后5dA組(4.339±0.196)α

7、SMA mRNA表達明顯高于對照組(2.043±0.159)(P<0.05)，B組(0.797±0.023)和C組(1.214±0.121)αSMA mRNA表達明顯低于對照組(2.043±0.159)(P<0.05)。術后10d A組(1.941±0.220)αSMA mRNA表達量明顯高于對照組(1.494±0.054)(P<0.05)。B組(1.108±0.257)和C組(1.373±0.163)αSMA mRNA表達量與對照組(

8、1.494±0.054)無統計學顯著差異(P>0.05)。病理組織切片HE染色術后1d前囊膜LEC增殖，后囊膜未見LEC附著。術后3d后囊膜見LEC移行、附著。免疫組織化學法檢測術后5d A組和B組囊膜間隙LECαSMA染色陽性。 結論：兔眼晶狀體前囊膜片再植入術后房水中總量TGFβ2濃度升高，維持高水平超過28d；活性TGFβ2濃度降低，至術后7d恢復到術前水平。TGFβ2抗體可以對抗TGFβ2抑制LEC增殖的作用，減少通用型