CypA-CD147活化B細胞參與類風濕關節(jié)炎及急性B淋巴細胞白血病機制的探討.pdf

1、類風濕關節(jié)炎(Rheumatoidarthritis，RA)是一種系統(tǒng)性的自身免疫性疾病，雖然其確切的發(fā)病機制還不清楚，但普遍認為可能是由外源性或內源性的抗原對具有某些遺傳易感背景的人觸發(fā)一系列在滑膜中的自身免疫反應。其臨床特點為累及周身關節(jié)的增殖性和侵蝕性滑膜炎，是類似于“局限性惡性腫瘤(locallyinvasivetumor)”的增生性和破壞性病變，呈進行性發(fā)展，自行緩解罕見。
　　以往的研究證實了RA的滑膜細胞及巨噬細胞通

2、過分泌基質金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinase，MMPs)對關節(jié)軟骨的破壞及加重疾病的病情，而其中CD147分子則是已知的一個MMPs重要調節(jié)因子。CD147又稱為細胞外基質金屬蛋白酶誘導劑(extracellularmatrixmetalloproteinaseinducer,EMMPRIN)，廣泛表達于人血管內皮細胞、外周血細胞、造血系統(tǒng)起源的細胞表面，屬于免疫球蛋白超家族，細胞環(huán)親素A(yclophilinA

3、，CypA)的受體之一。在RA關節(jié)腔內大量存在的CypA同樣作為一個重要的促炎因子，在其他許多炎性及腫瘤等疾病中的作用都見報道，本實驗室以往的研究顯示CypA對RA滑液中的單個核細胞的趨化作用顯著高于正常人外周血單個核細胞，且這一作用可被抗CD147抗體所阻斷，提示了單個核細胞膜CD147分子可能參與了CypA對單個核細胞的趨化調節(jié)作用。但是到目前為止，對于CypA與CD147相互作用于淋巴細胞，尤其是B淋巴細胞的報道未曾見到。RA的滑

4、膜下層可有大量的T細胞(CD4＋細胞為主)、B細胞，巨噬細胞及漿細胞浸潤，侵入的單個核細胞集聚在一起可形成淋巴樣濾泡，少數(shù)發(fā)展成生發(fā)中心；生發(fā)中心的漿細胞有合成免疫球蛋白和RF的能力。
　　然而，RA滑膜局部B細胞活化增生以及漿細胞抗體類別轉化的機制尚不明確，通過對CypA與CD147相互作用、CypA在RA滑液內大量存在及CD147在RA中單核/巨噬細胞高表達等文獻回顧以及本實驗在單個核細胞研究實驗基礎上，本課題擬觀察這一相互作

5、用在B淋巴細胞是否也存在，初步研究CypA對滑膜及滑液中B細胞上CD147的表達，以及對B細胞活化分泌自身抗體作用的研究。
　　流式細胞儀(flowcytometry，F(xiàn)CM)分析正常個體的外周血提示：B細胞的一小部分，T細胞和單核細胞表達EMMPRIN，然而在ATLL患者中，表達EMMPRIN的T細胞數(shù)目是多的，蛋白的表達水平是異常高的。體外，EMMPRIN表達陽性的人類T細胞親淋巴病毒Ⅰ型(humanT-celllymphom

6、avirus，HTLV-1)轉化的淋巴細胞(transformedlymphocyte，MT-2)和EMMPRIN表達陰性人成纖維細胞共培養(yǎng)比單獨培養(yǎng)提高了前-MMP-2(明膠酶A)和活化MMP-2的產生。這些刺激可被拮抗EMMPRIN的活化阻斷蛋白抑制。
　　近年來大量的資料顯示慢性炎癥在一些腫瘤從癌前階段演化為完全癌癥中發(fā)揮重要角色。腫瘤和炎癥之間的鏈接很長時間都成為人們的疑點。本實驗室以往的研究顯示CypA通過單個核細胞膜C

7、D147分子參與對該細胞的趨化調節(jié)作用，CD147分子在健康人成熟單個核細胞的表達與增生的炎癥細胞(癌前細胞)及腫瘤細胞的表達呈依次增高的趨勢。但關于CD147在炎癥和腫瘤中活化B細胞上的表達水平研究尚未見報道，以及在B細胞不同活化階段cyclophilin-CD147作用發(fā)生疾病機制的研究尚未探討。
　　因此，本課題研究將CypA通過CD147分子相互作用、CD147分子介導信號通路的研究思路用于CD147在B細胞不同發(fā)育轉化階

8、段表達中的研究，該結果對進一步認識CypA、CD147分子及兩者相互作用復合物在炎癥、癌前病變以及腫瘤轉化過程中發(fā)病機制的作用有著重要的意義，并為探索炎癥和腫瘤轉化中的生物標記及靶向治療提供了良好的理論基礎。
　　方法：
　　1.CyclophilinA-CD147活化B細胞在RA發(fā)病中的作用
　　收集RA患者嚴重骨侵襲者取膝關節(jié)滑膜組織，首先制備組織切片，采用免疫組化染色(分別用CD19、CD35、CD38標記B淋巴

9、細胞、濾泡樣樹突狀細胞、漿細胞)觀察RA滑膜組織中B淋巴細胞生發(fā)中心的形成，進而免疫組化染色觀察CD147在其中的表達分布特點；分離RA滑液單個核細胞，加入CypA，B細胞活化因子(BAFF)，脂多糖(LPS)作用細胞，于12、24、48h，分別收集培養(yǎng)懸浮單個核細胞，采用三重標記法(CD147-FITC、CD3-PrecP、CD19-APC)，流式細胞術法測定相關分子。檢測不同刺激后CD19+B細胞表面CD147表達MFI的變化；收集

10、CypA，BAFF，LPS作用后滑液細胞的培養(yǎng)上清，檢測RF亞型，抗CCP抗體，及免疫球蛋白的分泌水平，并用滑液中總免疫球蛋白校正。觀察不同刺激作用后自身抗體分泌水平。
　　2.急性B淋巴細胞白血病為代表的血液系統(tǒng)腫瘤中B細胞CD147的表達
　　為了研究CD147在急性白血病患者骨髓白血病細胞上的表達，尤其是幼稚B細胞上的表達，本實驗采用流式細胞術三色免疫熒光直接標記技術檢測，比較健康供者和急性白血病患者及其治療緩解期患者

11、骨髓中不同細胞亞群尤其是白血病細胞上CD147表達的差異，并追蹤觀察骨髓移植或者化療后CD147表達的變化。
　　3.CypA通過CD147促進B淋巴瘤細胞侵襲和轉移的體內研究
　　為了進一步深入研究是否CypA通過CD147途徑參與B細胞的免疫學機制，并排除其它因素的干擾，本研究選取表型為CD19+CD10+CD147high的B細胞淋巴瘤細胞系Raji細胞，體外經CypA作用后經尾靜脈注入Scid小鼠體內，觀察Raji細

12、胞在Scid小鼠體內侵襲和轉移情況以及分泌MMP等方面的功能機制。
　　結果：
　　1.CD147在RA滑膜淋巴樣組織中的表達與分布，CypA對滑液B細胞表達CD147的調節(jié)
　　15例RA患者，均具有膝關節(jié)嚴重骨侵襲以及典型RA臨床表現(xiàn)，取滑膜標本收集滑液分離單個核細胞。組織學和免疫組化結果顯示，15例RA患者滑膜標本中13例有生發(fā)中心樣的組織結構，并且13例RA滑膜組織濾泡樣生發(fā)中心中均存在不同程度的CD147的表

13、達。其中陽性6例，強陽性7例。鏡下計數(shù)在13例RA滑膜淋巴濾泡中CD147表達陽性的細胞，淋巴細胞30±8％，濾泡樣樹突裝細胞細胞平均為32±7％，血管內皮細胞平均為38±11％，漿細胞細胞幾乎不表達；進一步本實驗通過CypA，BAFF，LPS作用以上13例滑膜存在淋巴濾泡樣組織結構RA患者滑液單個核細胞，收集懸浮細胞及上清，檢測不同刺激后CD19+B細胞表面CD147表達MFI的變化及自身抗體分泌水平，提示：CypA(200ng/ml

14、)，BAFF(25ng/ml)，LPS(20ng/ml)作用后48hCD19+B細胞表面CD147表達MFI、RF和anti-CCP水平最高，顯著高于刺激前水平(p<0.01)，且CypA與BAFF、LPS作用間無顯著差異(p>0.05)。
　　2.急性B淋巴細胞白血病為代表的血液系統(tǒng)腫瘤中B細胞CD147的表達
　　流式細胞術分析顯示，急性白血病初發(fā)患者的骨髓中，白血病細胞膜表面CD147表達的平均熒光強度(meanflu

15、orescenceintensity，MFI)(97.96±14.07，p<0.01)顯著高于健康供者(66.61±15.59)和治療緩解期患者(73.72±8.54)，其他細胞群(淋巴細胞，中性粒細胞，有核紅細胞)CD147表達的MFI亦顯著高于健康供者及治療緩解期患者(p<0.01)；進一步比較急性B淋巴細胞白血病初發(fā)患者白血病細胞CD147的表達(105.96±5，p<0.01)顯著高于健康供者白血病細胞群中幼稚B系細胞(CD10

16、/CD19)(35.76±8.49)，而急性B淋巴細胞白血病骨髓移植治療后CD147的表達亦降低(58.46±1.26，比較健康供者p<0.05)。同時，分析比較不同急性白血病亞型的CD147表達時發(fā)現(xiàn)，急性B淋巴細胞白血病(ALL-B)骨髓中白血病細胞亞群CD147的表達(105.96±5)顯著高于患者本人骨髓中成熟B淋巴細胞(43.46±12.34，p<0.01)。并在ALL-B不同亞型的患者骨髓中白血病細胞亞群CD147的表達時發(fā)

17、現(xiàn)，越幼稚亞型的ALL-B患者骨髓中白血病細胞亞群CD147的表達越高，隨著幼稚細胞百分率的增高CD147的表達也增高，并且其表達在治療緩解期患者的表達中有回歸健康供者表達特點的趨勢，這一免疫分型的分布特點有一定的規(guī)律性。然而分析其它急性白血病的幼稚細胞并沒有發(fā)現(xiàn)明顯的規(guī)律性。
　　3.CypA通過CD147促進B淋巴瘤細胞侵襲和轉移的體內研究
　　流式細胞術顯示Raji細胞大多為CD19＋CD10＋細胞(約占85％)，證明

18、其為較幼稚的B淋巴細胞，并且表面均表達CD147，MFI達到337.56，即為CD19+CD10+CD147high表達，符合進一步功能實驗細胞株的要求。體外用CypA(200ng/ml)作用Raji細胞培養(yǎng)48h后，經尾靜脈免疫注入Scid小鼠，3周后觀察其PBMC，骨髓細胞，肝細胞，脾臟細胞中CD147+細胞轉移情況，發(fā)現(xiàn)：用未經處理的Raji細胞免疫小鼠，其骨髓細胞中(15.07±5.43％)、肝細胞中分別為(25.75±6.58

19、％)、脾臟細胞中分別為(19.13±4.33％)，CD19+CD10+CD147+細胞百分率顯著低于經CypA作用的Raji細胞免疫小鼠，分別為(21.11±6.02％)、(47.77±10.23％)、(39.65±7.23％，p<0.01)。而對小鼠的肝臟和脾臟的組織學和免疫組化研究顯示，輸注未經或CypA作用過的Raji細胞，兩組小鼠CD19+CD10+CD147+細胞熒光表達沒有顯著差異。并且MMP-9組成以溶解形式存在于免疫小鼠

20、血清中，體外CypA(200ng/ml)作用Raji細胞48h后，Scid小鼠血清MMP-9水平顯著高于未經處理的Raji細免疫組。
　　結論：
　　本研究提示CD147可能作為生物標志用于急性白血病特別是急B淋的早期診斷和預測治療后復發(fā)；CypA、CD147有可能是RA和急性白血病特別是急B淋的藥靶。深入研究將有助于闡明CypA與CD147相互作用參與炎癥、癌前病變以及腫瘤轉化過程的發(fā)病機制，探索抗炎和抗腫瘤靶向治療的新策