奶牛白色念珠菌性乳腺炎的快速診斷及中藥治療研究.pdf

1、為了尋找一種能夠快速診斷奶牛白色念珠菌性乳腺炎的方法和有效治療該病的中藥方劑，本研究進行了共四個部分的試驗，第一部分根據(jù)白色念珠菌ITS1-ITS2部分的保守序列設計了一對特異性引物，建立了奶牛白色念珠菌性乳腺炎的PCR檢測方法；第二部分通過中藥藥敏試驗，本著中醫(yī)辯證施治的原理，自擬了治療奶牛白色念珠菌性乳腺炎的純中藥方劑“乳炎消”；第三部分則對篩選出的中藥方劑的急性毒性和細胞毒性進行了檢測；第四部分以奶山羊為實驗動物模型進行了中藥治療

2、白色念珠菌性乳腺炎的研究，并進行了“乳炎消”方劑的臨床治療試驗。 第一部分用PCR方法診斷奶牛白色念珠菌性乳腺炎的研究查閱了GenBank已發(fā)表的ITS1-ITS2序列，根據(jù)白色念珠菌ITS1-ITS2部分的保守序列設計了一對特異性引物，對患牛乳樣中分離到的4珠白色念珠菌進行了PCR擴增，結果表明，擴增產(chǎn)物均為500bp，檢測工作僅耗時2.5h；同時，對照試驗表明，該對引物不能擴增大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌等常見的乳房

3、炎致病細菌。敏感性實驗結果表明，該方法的敏感性可達到1.25x103CFU/mL。對50份患牛乳樣進行了細菌學培養(yǎng)和生化實驗檢測及PCR檢測，結果傳統(tǒng)方法檢測到白色念珠菌的陽性率為16％，而PCR方法檢測到白色念珠菌的陽性率為18％。傳統(tǒng)方法檢測為陽性的樣品，PCR檢測全部為陽性。因此，用PCR方法檢測奶牛白色念珠菌性乳腺炎是一種快速、敏感和特異的方法，對獸醫(yī)臨床中白色念珠菌性乳腺炎的診斷具有一定的參考價值。 第二部分治療奶牛酵

4、母菌性乳腺炎中藥方劑的篩選本著中醫(yī)辨癥施治的原理，以調氣活血、消腫散淤、提高機體免疫力為原則，自擬了三組中藥方劑，進行了單味中藥及三組自擬中藥方劑的體外平板抑菌試驗，各單味中藥結果表明：黃連和黃芩對4種酵母菌的抑制作用均較強；而蒲公英、連翹、魚腥草對酵母菌沒有抑制作用；苦參、升麻、姜黃、仙鶴草對不同的酵母菌有一定的抑制作用。三組方劑結果表明：方劑1的抑菌效果明顯好于其它兩組方劑。在方劑1的基礎上調整篩選組方，最后篩選出一種純中藥方劑，定

5、名為“乳炎消”，并進行了MIC(最低抑菌濃度)試驗。結果表明，該方劑對白色念珠菌等奶牛酵母菌性乳腺炎的主要致病菌具有較好的抑菌效果，MIC值較低，平均為0.116g/mL。 第三部分中藥“乳炎消”方劑毒性檢測為了確保臨床用藥安全，通過不同的試驗途徑和方法測定方劑“乳炎消”對小鼠的急性毒性和對L929(小鼠成纖維母細胞)細胞的毒性。體內急性毒性試驗進行了半數(shù)致死量(LD50)和最大耐受量(MTD)為的檢測，用40g/kg體重劑量的

6、乳炎消方劑給小鼠灌胃，1周后小鼠未發(fā)生死亡，再在小鼠可接受的最大容積下，給小鼠灌服日累積劑量為120g/kg體重的乳炎消方劑進行MTD試驗，1周后處死觀察其病理變化。體外細胞毒性試驗采用形態(tài)學觀察和MTT兩種方法，測試乳炎消方劑在L929體外培養(yǎng)中的最大無毒濃度(TC0)。結果表明；(1)乳炎消方劑毒性很低，其LD50超過40g/kg體重，MTD超過120g/kg體重。根據(jù)毒性分級標準，可認為中藥方劑在短期內使用是安全的。(2)體外培養(yǎng)

7、結果顯示，乳炎消方劑對L929細胞的最大無毒濃度達1.56g/L。 第四部分“乳炎消”方劑的治療效果研究本試驗以30頭健康泌乳奶山羊為試驗動物，將其分為三組：正常對照組、發(fā)病用藥組和發(fā)病末用藥組，每組10只。用白色念珠菌菌液1mL從乳頭管注入發(fā)病用藥組和發(fā)病末用藥組奶山羊的乳室，成功地誘發(fā)奶山羊急性乳炎腺的發(fā)生，48h后出現(xiàn)紅、腫、熱、痛等炎癥反應，并伴有精神萎靡，食欲下降等癥狀。并從患羊乳汁中分離到白色念珠菌。用乳炎消方劑給發(fā)

8、病用藥組灌服(2mL/kg體重)，每天一次，連用5天后發(fā)病用藥組羊只有8只康復，2只癥狀明顯減輕。而發(fā)病未用藥的羊只癥狀加重或無明顯改善，用藥前后分別采集三組奶山羊的血樣和乳樣進行了血液流變學分析、淋巴細胞轉化試驗和乳成份分析，血液流變學指標的測定表明，治療前發(fā)病羊只的全血粘度、全血還原粘度、血漿粘度、紅細胞聚集指數(shù)和剛性系數(shù)均顯著高于正常對照組(P＜0.05)，治療后發(fā)病用藥組上述指標基本恢復正常，而發(fā)病末用藥組的各項指標仍顯著高于正

9、常對照組(P＜0.05)。淋巴細胞轉化試驗表明，治療前發(fā)病羊只的淋巴細胞轉化率顯著低于正常照組(P＜0.05)，治療后發(fā)病用藥組這一指標基本恢復正常，而發(fā)病未用藥組仍顯著高于正常對照組。乳成分對比分析發(fā)現(xiàn)，治療前發(fā)病羊只的乳糖、乳脂肪顯著低于正常對照組(P＜0.05)，而乳蛋白、體細胞數(shù)顯著升高(P＜0.05)，治療后發(fā)病用藥組上述指標基本恢復正常，而發(fā)病末用藥組無明顯變化。證明該中藥方劑能夠有效治療白色念珠菌性乳腺炎。 臨床治