易損斑塊動物模型的構(gòu)建和基因治療穩(wěn)定易損斑塊的實驗研究.pdf

1、背景 動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)易損斑塊破裂是急性冠脈綜合征(Acutecoronary syndrome，ACS)的主要發(fā)病機(jī)制。斑塊的易損性是決定斑塊破裂的內(nèi)在因素，易損斑塊的特征主要包括薄的纖維帽、大的脂質(zhì)核和大量炎癥細(xì)胞的積聚。斑塊的應(yīng)力．應(yīng)變狀態(tài)改變是觸發(fā)斑塊破裂的外部因素。 易損斑塊的早期識別和干預(yù)對于急性心血管事件的預(yù)防具有十分重要的意義。研究動脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定的因素，促使易損

2、斑塊向穩(wěn)定方向轉(zhuǎn)變，是預(yù)防心腦血管事件的重要方法。易損斑塊發(fā)生發(fā)展機(jī)制和預(yù)防、治療等一系列研究均依賴于一個理想的動物模型，然而，目前的動物模型仍不夠完善，主要存在以下幾點(diǎn)問題：①斑塊破裂的發(fā)生與人類病變的發(fā)展情況不夠一致；②斑塊內(nèi)缺乏炎癥反應(yīng)；③斑塊自發(fā)破裂率低，破裂處富含血小板和纖維蛋白的血栓少見。 另一方面，由于儀器功能的限制，以往對小動物模型易損斑塊的檢測多集中于后期的組織學(xué)分析。晚近，高分辨率顯微超聲技術(shù)被用于追蹤觀察a

3、poE基因敲除(apoE-/-)小鼠AS病變的發(fā)展。是否該技術(shù)亦可用于早期識別apoE-/-小鼠體內(nèi)的易損斑塊?目前國內(nèi)外尚無相關(guān)報道。 針對上述問題，本研究在apoE-/-小鼠高脂飲食的基礎(chǔ)上，給予脂多糖和精神應(yīng)激刺激，擬在通過多因素的聯(lián)合干預(yù)構(gòu)建斑塊自發(fā)破裂率高的AS易損斑塊動物模型，闡述多因素聯(lián)合干預(yù)致斑塊易損的機(jī)制。同時，應(yīng)用顯微超聲技術(shù)檢測模型在體的易損斑塊，評價顯微超聲在apoE-/-小鼠易損斑塊識別中的應(yīng)用價值。

4、 目的 1.通過多重因素聯(lián)合干預(yù)構(gòu)建高度模擬人類AS病變的易損斑塊動物模型。 2.闡述多重因素聯(lián)合干預(yù)促進(jìn)斑塊破裂的病理生理學(xué)機(jī)制和分子生物學(xué)機(jī)制。 3.評價顯微超聲在apoE-/-小鼠易損斑塊識別中的應(yīng)用價值。 方法 1.動物實驗：108只10-12周齡的雄性apoE-/-小鼠實驗全程高脂飲食(含0.25﹪膽固醇和15﹪脂肪)喂養(yǎng)。實驗動物隨機(jī)分為4組：應(yīng)激組，脂多糖組，脂多糖/應(yīng)激組和對

5、照組，每組27只。全部實驗鼠均于實驗初行左頸總動脈套管(縮窄性硅膠管)術(shù)以誘發(fā)AS病變。脂多糖組于頸動脈套管手術(shù)4周后給予脂多糖腹腔注射(1mg/kg，每周2次，持續(xù)8周)；應(yīng)激組于頸動脈套管手術(shù)8周后給予精神應(yīng)激刺激(足底電擊和噪音刺激，每天1小時，持續(xù)4周)；應(yīng)激/脂多糖組聯(lián)合給予應(yīng)激和脂多糖刺激；對照組不給任何刺激。 2.血流動力學(xué)評價：實驗?zāi)┢谕ㄟ^鼠尾測壓儀測量實驗鼠的收縮壓、舒張壓和心率：通過顯微超聲儀測量頸動脈斑塊部

6、位最大血流速度(Vmax)和左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)，評價機(jī)體全身和局部的血流動力學(xué)狀態(tài)。 3.易損斑塊的超聲影像學(xué)形態(tài)特征：應(yīng)用顯微超聲技術(shù)測量斑塊長度、外彈力膜面積(EEMA)、斑塊面積、內(nèi)膜.中層厚度(IMT)和斑塊近端的Vmax。計算斑塊的偏心指數(shù)(EI)和重構(gòu)指數(shù)(RI)。 4.血清去甲腎上腺素(NE)和生化指標(biāo)檢測：末次應(yīng)激實驗結(jié)束后，即刻予全部動物眼球后采血。測定血清中NE、高敏C.反應(yīng)蛋白(hsCRP)、

7、血脂和血漿纖維蛋白原濃度。 5.病理學(xué)檢測：頸動脈斑塊組織學(xué)切片分別行蘇木素.伊紅染色、Masson三染、天朗猩紅染色、Verhoeff染色、油紅O染色、Perl's染色(含鐵血黃素染色)，并進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色觀察巨噬細(xì)胞(MOMA.2)、平滑肌肌動蛋白(a-SM-actin)的局部表達(dá)。測量斑塊面積、血管面積和纖維帽厚度；測量膠原、脂質(zhì)、平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞免疫組化陽性染色面積，并計算它們占斑塊面積的比例。統(tǒng)計斑塊的破裂率，

8、計算易損指數(shù)。易損指數(shù)=(巨噬細(xì)胞+脂質(zhì))面積陽性百分比/(平滑肌細(xì)胞+膠原)面積陽性百分比。 6.實時定量RT-PCR：實時熒光定量RT-PCR反應(yīng)檢測斑塊內(nèi)IL-6、IL-18、TNF-α、MCP-1、MMP9、MMP12 mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果1.動物的基本特征：應(yīng)激/脂多糖組有1只動物于首次注射脂多糖后死亡，其余動物全部完成實驗。動物各組間體重?zé)o明顯差異。 2.血流動力學(xué)評價：應(yīng)激顯著增加收縮壓、舒張壓、心率、

9、Vmax和LVEF(均P<0.001，F(xiàn)actorialANOVA)。應(yīng)激和應(yīng)激/脂多糖組收縮壓、舒張壓、心率、Vmax和LVEF顯著高于脂多糖組(均P<0.001)和對照組(均P<0.001)。 3.As易損斑塊影像學(xué)特征：顯微超聲測量的斑塊面積(r=0.606，P=0.004)、IMT(r=0.777，P<0.001)、偏心指數(shù)(r=0.784，P<0.001)和重構(gòu)指數(shù)(r=0.854，P<0.001)與組織學(xué)檢測結(jié)果有顯

10、著的相關(guān)性。破裂斑塊的平均IMT(0.344±0.09比0.224±0.07 mm.P<0.001)和EI(0.72±0.15比0.4±0.18，P<0.001)均顯著高于非破裂組。71.4﹪的破裂斑塊呈現(xiàn)明顯的血管正性重構(gòu)，破裂組的平均重構(gòu)指數(shù)顯著高于非破裂組(1.1±0.15比1.03±0.07，P=-0.002)。破裂斑塊組近端的Vmax顯著高于非破裂斑塊組(1.22 4±0.34比0.79 4±0.25 m/s，P<0.001)

11、。Logistic回歸分析結(jié)果顯示斑塊IMT和斑塊近端的Vmax是預(yù)測斑塊破裂的獨(dú)立因素，其OR值分別為1.017(95﹪CI：1.004-1.030)和1.005(95﹪CI：1.001-1.009)。 4.血液NE和生化檢測：應(yīng)激顯著升高血清NE水平(P<0.001，F(xiàn)actorial ANOVA)。應(yīng)激組和應(yīng)激/脂多糖組的NE濃度明顯高于脂多糖組(均P<0.001)和對照組(均P<0.001)。應(yīng)激和脂多糖均明顯導(dǎo)致血清h

12、sCRP濃度升高(均P<0.001，F(xiàn)actorial ANOVA)，并且應(yīng)激與脂多糖聯(lián)合作用具有協(xié)同作用(P=0.003，F(xiàn)actorial ANOVA)，聯(lián)合處理組的hsCRP水平顯著高于應(yīng)激組(P<0.001)和脂多糖組(P<0.001)。各組間總膽固醇、甘油三酯、高密度膽固醇和低密度膽固醇濃度均沒有統(tǒng)計學(xué)差異。應(yīng)激和脂多糖均顯著增加血漿纖維蛋白原濃度(均P<0.001，F(xiàn)actorial ANOVA)，應(yīng)激/脂多糖組的纖維蛋白原

13、濃度顯著高于應(yīng)激組(P<0.001)和脂多糖組(P<0.001)。 5.應(yīng)激和脂多糖聯(lián)合刺激產(chǎn)生的AS易損斑塊表型：應(yīng)激和應(yīng)激/脂多糖組斑塊破裂率均顯著高于對照組(P=0.036，0.036)。應(yīng)激/脂多糖組中2例發(fā)生斑塊破裂伴腔內(nèi)血栓，1例發(fā)生斑塊內(nèi)出血。應(yīng)激組有1例斑塊肩部斷裂伴出血。各組間斑塊面積沒有統(tǒng)計學(xué)差異。應(yīng)激和脂多糖刺激均顯著降低斑塊纖維帽厚度(均P<0.001，F(xiàn)actorial ANOVA)，降低帽/核比值(均

14、P<0.001，F(xiàn)aetodalANOVA)，并且聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同效應(yīng)(P=0.048，0.019，F(xiàn)actorial ANOVA)。應(yīng)激/脂多糖組的膠原含量顯著減少(均P<0.01)，脂質(zhì)含量顯著增加(均P<0.01)，巨噬細(xì)胞明顯增多(均P<0.05)。應(yīng)激和脂多糖聯(lián)合應(yīng)用對巨噬細(xì)胞和膠原含量有顯著的協(xié)同效應(yīng)（P=0.013，0.043，F(xiàn)actorial ANOVA)。各組間斑塊內(nèi)平滑肌細(xì)胞含量沒有統(tǒng)計學(xué)差異。應(yīng)激/脂多糖組斑塊的

15、易損指數(shù)為2.53±0.54，顯著高于其它各組(對照組：0.85±0.07，P<0.001；脂多糖組：1.81±0.14，P=0.001；應(yīng)激組：1.78±0.12，P=0.001)。 6.斑塊內(nèi)基因的表達(dá)：應(yīng)激顯著增加斑塊內(nèi)IL-6(P=0.001)、IL-18(P=0.01)、TNF-α[(P=0.044)、ICAM-1(P=0.018)、MCP-l(P<0.001)、TF(P=-0.014)、MMP9(P=0.007)和MMP12

16、(P=0.039)的表達(dá)；脂多糖顯著增加斑塊內(nèi)IL-6(P=0.030)、ICAM-1(P=0.022)、TF(P=0.049)和MCP-1(P=-0.017)的表達(dá)。應(yīng)激/脂多糖組斑塊內(nèi)各炎性因子和MMPs的表達(dá)量均顯著高于對照組(均P<0.05)，其中MCP-1和MMP9的表達(dá)明顯高于脂多糖組(P=0.004，0.023)。 結(jié)論 1.在高脂喂養(yǎng)的apoE-/-小鼠的頸動脈，先通過套置縮窄性套管的方法誘發(fā)AS斑塊形成

17、，再通過精神應(yīng)激聯(lián)合脂多糖刺激的方法促進(jìn)斑塊發(fā)生易損性改變，并自發(fā)破裂。這種多因素聯(lián)合干預(yù)導(dǎo)致的斑塊破裂模型，其自發(fā)破裂率高，并伴發(fā)血栓形成和斑塊內(nèi)出血，與人類病變極為相似。 2.機(jī)體的高血流動力學(xué)反應(yīng)、高凝狀態(tài)和炎癥反應(yīng)增強(qiáng)是促進(jìn)斑塊自發(fā)破裂，并伴發(fā)血栓形成的主要機(jī)制。應(yīng)激激活交感神經(jīng)系統(tǒng)，血液NE濃度升高，血流動力學(xué)反應(yīng)增強(qiáng)，使斑塊的應(yīng)力.應(yīng)變狀態(tài)發(fā)生改變。在應(yīng)激和脂多糖聯(lián)合作用下血液纖維蛋白原升高，血液高凝；血液中的hsC