可溶性Aβ-,25-35-對新生大鼠海馬CA3區(qū)錐體神經(jīng)元延遲整流鉀通道m(xù)RNA表達影響的研究.pdf

1、目的： Alzheimer’s病(AD)是影響記憶和認知功能的進行性退化性神經(jīng)病變，是癡呆最常見的原因。研究表明，β淀粉樣蛋白(Aβ)增加是AD中樞病因性過程，凝聚態(tài)Aβ具有明確的神經(jīng)毒性作用。但亦有研究提出，Aβ在纖維性沉積前即可溶性Aβ也可產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用。海馬是學習和記憶的關鍵部位，直接參與記憶的獲取和建立。海馬CA3區(qū)與空間辨別性學習記憶關系密切。而學習和記憶存儲的分子和生理機制研究表明，鉀通道、蛋白激酶C、記憶相關蛋白

2、Cp20、細胞內(nèi)鈣調節(jié)在學習和記憶機制中起重要作用，其中鉀離子通道在學習和記憶中起著關鍵作用，提示鉀通道在老年癡呆發(fā)病過程中具有重要意義。有研究認為可溶性Aβ25-35對新生大鼠海馬CA3區(qū)錐體神經(jīng)元延遲整流鐘電流(Ik)有明顯抑制作用，其效應具有時間依賴性和電壓依賴性，但具體作用機制不清。本實驗以大鼠海馬CA3區(qū)錐體神經(jīng)元為研究對象，采用膜片鉗與單細胞RT-PCR技術相結合的方法，研究可溶性Aβ25-35對新生大鼠海馬CA3區(qū)錐體神經(jīng)

3、元幾種代表性延遲整流鉀通道亞型mRNA表達的影響，從分子生物學的角度探討Ik變化的分子機制。為研究Aβ在AD發(fā)病過程中的作用機制以及臨床應用鉀通道調節(jié)劑預防和治療AD提供理論依據(jù)。 方法： 采用酶解和機械分離相結合的方法，急性分離新生大鼠海馬CA3區(qū)錐體神經(jīng)元。運用膜片鉗，借助其電極形成的吸收通道提取單個細胞，然后對其進行單細胞水平的分子生物學研究。由于單個細胞中提取的mRNA數(shù)量很少，應用傳統(tǒng)的單對引物對單細胞mRNA

4、進行RT-PCR擴增，得到的產(chǎn)物結果不夠理想，故本實驗采用的巢式設計的兩對PCR引物，進行兩輪PCR擴增。RT-PCR擴增后凝膠電泳成像分析，觀察可溶性Aβ25-35對大鼠海馬CA3區(qū)錐體神經(jīng)元延遲整流鉀離子通道亞型Kv1.2、Kv1.5、Kv2.1表達的影響。 結果： 1.延遲整流鉀通道亞型Kv1.2，Kv1.5，Kv2.1在正常大鼠海馬CA3區(qū)錐體神經(jīng)元上均有不同程度的表達。其中，Kv2.1的表達水平較高。

5、2.加入濃度為1.0、2.5、5.0μM可溶Aβ25-351分鐘后，大鼠海馬CA3區(qū)錐體神經(jīng)元延遲整流鉀通道亞型Kv1.2mRNA的相對表達量與對照組相比明顯降低，分別降低15.9％(P<0.01)、24.0％(P<0.01)、35.8％(P<0.01)。 3.加入濃度為1.0、2.5、5.0μM可溶性Aβ25-351分鐘后，大鼠海馬CA3區(qū)錐體神經(jīng)元延遲整流鉀通道亞型Kv1.5mRNA的相對表達量與對照組相比明顯降低，分別降低

6、17.8％(P<0.01)、23.2％(P<0.01)、36.1％(P<0.01)。 4.加入濃度為1.0、2.5、5.0μM可溶性Aβ25-351分鐘后，大鼠海馬CA3區(qū)錐體神經(jīng)元延遲整流鉀通道亞型Kv2.1mRNA的相對表達量與對照組相比明顯降低，分別降低17.2％(P<0.01)、23.7％(P<0.01)、36.9％(P<0.01)。 5.加入濃度為5.0μM可溶性Aβ25-35孵育1、3、5、8、10分鐘后，大

7、鼠海馬CA3區(qū)錐體神經(jīng)元延遲整流鉀通道亞型Kv2.1mRNA的相對表達量與對照組相比明顯降低，分別降低了38.7％(P<0.01)、43.5％(P<0.01)、53.3％(P