基于生物芯片的DNA測序以及DNA甲基化檢測方法的研究.pdf

1、生物芯片是一種高通量的工具，可以一次性對大量序列進行檢測和基因分析，能解決傳統(tǒng)的核酸印跡雜交操作復雜、成本高、效率低等缺點。
　　 人類基因組計劃推動了DNA測序技術的發(fā)展，合成測序是其中一種有發(fā)展?jié)摿蛻们熬暗臏y序方法?；蛐酒c合成測序相結合，可以降低測序成本，并實現(xiàn)快速以及高通量的測序。目前新一代測序技術還主要存在兩方面的問題：（1）基因組測序模板制備是以PCR（polymerase chain reaction）為基礎

2、，這種模板制備方法存在擴增的偏性；（2）測序中核酸的讀出采用熒光標記核苷酸的延伸，在每步延伸后需要切除熒光以避免熒光的累積。但切除步驟較為復雜，成本高、耗時長，并直接影響測序長度。針對上述兩個問題，本研究提出兩種解決方案：（1）以滾環(huán)擴增為基礎制備模板；（2）用淬滅劑直接對測序中的熒光進行淬滅。
　　 DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳學修飾，DNA的異常甲基化是導致癌癥發(fā)生的重要原因。DNA甲基化的檢測方法是DNA甲基化研究的基

3、礎，缺少高通量，高靈敏度的檢測技術是阻礙在基因組水平上研究DNA甲基化功能的關鍵原因。本研究基于亞硫酸氫鹽測序方法，提出了2種在芯片上進行滾環(huán)擴增制備分子克隆，通過芯片雜交無PCR擴增偏性高靈敏度檢測DNA甲基化的方法。
　　 1.以DABCYL為熒光淬滅劑的DNA測序研究
　　 熒光淬滅劑DABCYL能夠吸收熒光素等分子的激發(fā)能，通過能量轉移實現(xiàn)熒光淬滅。本論文提出了一種通過DABCYL淬滅核苷酸上熒光的合成測序方法，

4、并對熒光淬滅的條件進行了優(yōu)化。研究發(fā)現(xiàn)，對醛基修飾的玻片用0.1 mol/1的DABCYL在40℃時進行5分鐘處理，對于4種常用于核酸標記的熒光（FITC、Cy3、Cy5和TAMAR）的淬滅效率都在99％以上；熒光焠滅后再延伸效率在90％以上。熒光光譜研究發(fā)現(xiàn)在上述4種熒光基團中DABCYL對于Cy5的淬滅效率最低。實驗表明，采用以DABCYL為熒光焠滅劑的測序方法可測出17個堿基。
　　 2.以過氧化氫為淬滅劑對基于單引物滾環(huán)

5、擴增DNA測序模板的測序研究
　　 本研究提出了一種以滾環(huán)擴增（Rolling Circle Amplication，RCA）為基礎的測序模板制備方法。通過比較丙烯酰胺修飾的玻片、鏈親和素修飾的玻片以及醛基修飾的玻片，結果表明丙烯酰胺修飾的玻片對滾環(huán)擴增產(chǎn)物有較高的固定效率，在玻片上固定滾環(huán)擴增產(chǎn)物能夠進行在片延伸。過氧化氫作為一種較強的氧化劑，能破壞熒光素的分子結構，從而淬滅熒光。應用過氧化氫作為熒光淬滅劑淬滅測序中的核酸分子

6、標記的熒光。用30％H2O2在30℃處理5分鐘，對于Cy5的淬滅效率為67％左右。過氧化氫處理后核酸的再延伸效率達到80％。熒光光譜研究發(fā)現(xiàn)DABCYL對4種熒光（FITC、Cy3、Cy5和TAMAR）基團的淬滅效率從低到高的次序為Cy3>TAMAR>Cy5>FITC。實驗表明，對于滾環(huán)擴增制備的測序模板采用過氧化氫作為淬滅劑能夠測出27個堿基。
　　 3.以硫酸銅為淬滅劑對基于超分支滾環(huán)擴增制備的DNA測序模板的測序研究

7、>　　 為進一步提高滾環(huán)擴增產(chǎn)物的模板量，提出了在芯片上以超分支滾環(huán)擴增（Hyper-branched Rolling Circle Amplication，HRCA）為基礎制備DNA測序模板的方法。用丙烯酰胺修飾的玻片固定雙引物擴增的滾環(huán)產(chǎn)物。實驗表明，雙引物滾環(huán)擴增比單引物滾環(huán)擴增的產(chǎn)物多，并且HRCA產(chǎn)物制備的測序模板能夠進行在片延伸。應用硫酸銅作為熒光淬滅劑淬滅測序中的熒光，并對淬滅反應的溫度、濃度、時間進行優(yōu)化。研究表明，用

8、0.02 mol/1 CuSO4在30℃時對丙烯酰胺修飾的玻片進行5分鐘的處理，對Cy5的淬滅效率為97％，核酸的再延伸效率為95％。熒光光譜研究發(fā)現(xiàn)硫酸銅對用于核苷酸標記的4種熒光基團（FITC、Cy3、Cy5和TAMAR）淬滅效率從低到高的次序依次為TAMAR>Cy3>FITC>Cy5。實驗表明，對于超分支滾環(huán)擴增制備的DNA測序模板采用硫酸銅為淬滅劑能夠讀出42個堿基。
　　 4.基于磁珠的超支滾環(huán)擴增的甲基化檢測方法

9、r>　　 本章發(fā)展了基于磁珠的超支滾環(huán)擴增的甲基化檢測方法，采用超支滾環(huán)擴增及固相核酸擴增技術將均勻分布在固相載體中的不同類型的單個單鏈模板環(huán)原位高效地擴增出來，并牢固地固定在原來的位置，形成一種高密度的核酸分子克隆微陣列。通過變性電泳，將微陣列芯片上含有多個相同的核酸片段中未固定的核酸鏈去除，成功地制備出單條鏈分子克隆芯片。把陽性克隆和陰性克隆模板的量分別按照0:1，1：O，1:1的比例混合，進行在片擴增，用探針雜交。陽性模板環(huán)和陰

10、性模板環(huán)對應的紅色和綠色的點的比例分別接近于0:1，1:0，1:1，這些結果表明該方法能夠檢測基因甲基化。
　　 5.基于微乳液滾環(huán)擴增的甲基化檢測方法
　　 在BEAMing（beads，emulsion，amplification，and magnetic）技術基礎上發(fā)展了一種DNA甲基化檢測和定量分析方法。在乳液中進行超支滾環(huán)擴增，每個乳液中至多含有一個磁珠和一個模板。陽性模板環(huán)和陰性模板環(huán)的比例分別為0:1，1: