四種藥用植物化學(xué)成分及生物活性研究.pdf

1、本論文對紫花列當(dāng)Orobanche coerulescens Steph、睡蓮花Nymphaea candida Presl、新疆圓柏Juniperus sabina L.和黑紫橐吾Ligularia atroviolacea進行了化學(xué)成分分析、生物活性篩選以及藥理作用研究。全文由以下五部分組成。 第一部分紫花列當(dāng)化學(xué)成分及生物活性研究 紫花列當(dāng)Orobanche coerulescens Steph為列當(dāng)科列當(dāng)屬二年生

2、或多年生寄生草本植物，性溫、味甘，生長于沙丘、干草原、礫石沙地和戈壁之中，寄生在菊科蒿屬植物的根上，具有補腎、強筋之功效，用于腎虛、腰膝冷痛、陽痿遺精和神經(jīng)官能癥等疾病的治療。本論文在文獻調(diào)研基礎(chǔ)上對紫花列當(dāng)化學(xué)成分及生物活性進行了研究，并從免疫抗病毒角度探討紫花列當(dāng)中特征性成分類葉升麻苷的肝保護作用及其機制。 1）采用大孔樹脂、硅膠和Sephadex LH-20等色譜技術(shù)對紫花列當(dāng)進行系統(tǒng)的植物化學(xué)研究，從中分離得到19個化合

3、物，利用UV和NMR等波譜手段及理化性質(zhì)鑒定了其中的15個化合物，分別為類葉升麻苷（Ⅰ-1）、異類葉升麻苷（Ⅰ-2）、crenatoside（Ⅰ-3）、cistanoside F（Ⅰ-4）、sinapoyl-4-O-β-D-glucoside（Ⅰ-5）、腺苷（Ⅰ-6）、β-谷甾醇（Ⅰ-7）、齊墩果酸（Ⅰ-8）、琥珀酸（Ⅰ-9）、咖啡酸（Ⅰ-10）、原兒茶醛（Ⅰ-11）、對羥甲基苯甲酸（Ⅰ-12）、β-胡蘿卜苷（Ⅰ-13）、D-半乳糖醇（

4、Ⅰ-14）和甘露醇（Ⅰ-15）；除化合物Ⅰ-1、Ⅰ-2和Ⅰ-3外，其余化合物均為首次從該植物中分離得到。 2）通過大孔樹脂富集該藥材有效部位苯乙醇總苷，并采用HPLC測得其所含特征性成分類葉升麻苷的含量可達80％以上。 3）DPPH自由基清除試驗顯示紫花列當(dāng)提取物（苯乙醇總苷）及其所含的苯乙醇苷類化合物均具有較好的抗氧化能力，其清除DPPH自由基能力接近于抗壞血酸。 4）采用卡介苗（BCG）整體致敏、脂多糖（LP

5、S）離體攻擊構(gòu)建大鼠原代肝細胞免疫性損傷模型，在體外觀察類葉升麻苷的保肝作用。類葉升麻苷各劑量組在6、12和24h均可不同程度地使升高的AST和ALT下降，其作用與陽性對照藥物聯(lián)苯雙酯DDB相似；類葉升麻苷高劑量組在3h可顯著降低AST，并與低劑量組間存在顯著差異。此外，類葉升麻苷各劑量組在6、12和24 h均可不同程度地使升高的NO含量下降（P<0.01，P<0.05），其作用接近于陽性對照藥物DDB。 5）昆明種雄性小鼠72

6、只，隨機分為正常對照組、免疫性肝損傷模型組（BCG+LPS組）、DDB陽性對照組（200 mg/kg）以及類葉升麻苷低、中、高劑量組（50、150、300 mg/kg）共12組，測定并比較各組小鼠肝臟、脾臟系數(shù)，采用連續(xù)監(jiān)測法或比測法測定并比較各組小鼠肝組織勻漿中ALT、AST和超氧化物歧化酶（SOD）的活性以及丙二醛（MDA）和NO的含量，采用流式細胞儀測定各組小鼠外周血中CD4+/CD8+細胞亞群的比例，采用酶鏈免疫吸附法（ELIS

7、A）測定小鼠血清中干擾素-γ（IFN-γ）、白介素-10（IL-10）、白介素-2（IL-2）和白介素-4（IL-4）細胞因子的變化，采用免疫組化法觀察細胞凋亡基因Bax和Bcl-2在小鼠肝組織中的表達，并采用HE染色，觀察各組小鼠肝臟病理組織學(xué)變化。研究結(jié)果顯示，類葉升麻苷各劑量組均能不同程度的使肝組織SOD活性增高，MDA含量降低，且類葉升麻苷高劑量組升高組織SOD活性和降低MDA含量的能力與聯(lián)苯雙酯組接近，提示類葉升麻苷具有一定的

8、抗肝臟脂質(zhì)過氧化能力。應(yīng)用類葉升麻苷后，小鼠外周血中CD4+/CD8+細胞亞群的比例沒有發(fā)生變化，但使Th1型細胞因子IL-2、IFN-γ分泌量降低，Th2型細胞因子IL-4、IL-10的分泌量增加，降低Th1細胞的百分率，恢復(fù)Th1/Th2細胞比例的平衡，對肝組織損害具有保護和改善作用。此外類葉升麻苷各劑量組均能使小鼠肝細胞漿內(nèi)Bax蛋白的表達顯著降低，Bcl-2的表達顯著增加；說明類葉升麻苷在肝損傷細胞調(diào)亡的過程中，起到了抑制肝細胞

9、過度調(diào)亡的作用。 6）利用HepG2.2.15細胞考察了紫花列當(dāng)中類葉升麻苷、異類葉升麻苷等三個苯乙醇苷類化合物的抗乙肝病毒作用，結(jié)果顯示三個化合物均能抑制HBVsAg和HBV eAg的表達，并對HBV DNA的復(fù)制也有一定的抑制作用。 第二部分睡蓮花化學(xué)成分及生物活性研究 睡蓮花Nymphaea candida Presl為睡蓮科睡蓮屬多年生水生草本植物雪白睡蓮的干燥花蕾，主要分布于我國新疆的南部地區(qū)，在維吾爾

10、族民間用于熱癥引起的頭痛、熱感咳嗽及小兒急、慢驚風(fēng)等病癥的治療。本研究采用各種色譜技術(shù)方法對睡蓮花乙醇提取物進行系統(tǒng)地化學(xué)成分研究；并利用抗氧化能力測定、體外保肝和抗病毒等試驗對其進行生物活性研究。 1）采用大孔樹脂、硅膠和Sephadex LH-20等色譜技術(shù)從睡蓮花提取物中分離得到21個化合物，通過UV、MS和NMR等波譜技術(shù)及理化分析方法鑒定了其中的19個化合物，分別為沒食子酸（Ⅱ-1）、沒食子酸甲酯（Ⅱ-2）、蘆?。á?

11、3）、槲皮素（Ⅱ-4）、山奈酚（Ⅱ-5）、槲皮素3-甲醚（Ⅱ-6）、小麥黃素7-甲醚（Ⅱ-7）、異槲皮苷（Ⅱ-8）、黃芪苷（Ⅱ-9）、槲皮素3-O-甲基-3’-O-β-D-吡喃木糖苷（Ⅱ-10）、槲皮素3’-O-β-D-吡喃木糖苷（Ⅱ-11）、山萘酚3-O-蕓香糖（Ⅱ-12）、對二沒食子酸（Ⅱ-13）、間二沒食子酸（Ⅱ-14）、豆甾醇（Ⅱ-15）、1-二十二烷酸甘油酯（Ⅱ-16）、1-二十四烷酸甘油酯（Ⅱ-17）、正十六烷醇（Ⅱ-18）

12、和正二十二烷（Ⅱ-19）；其中Ⅱ-6～8、11～13和15～18為睡蓮屬植物首次報道。 2）DPPH·自由基清除試驗和還原能力測定顯示睡蓮花提取物及其所含的酚酸及黃酮類化合物均具有較好的抗氧化能力，其結(jié)果接近于陽性對照抗壞血酸；其中活性較強的乙酸乙酯部位（NCE）還具有較強的超氧陰離子、過氧化氫和羥自由基清除能力。 3）采用卡介苗整體致敏、脂多糖離體攻擊誘導(dǎo)的大鼠原代肝細胞免疫性肝損傷模型考察了睡蓮花乙酸乙酯提取物NCE

13、的保肝能力，試驗結(jié)果顯示NCE對血清中AST、ALT以及NO的影響接近于陽性對照藥甘利欣GRZ，說明NCE具有一定的保肝降酶作用。 4）利用HepG2.2.15細胞考察了睡蓮花乙酸乙酯提取物NCE的抗乙肝病毒作用。結(jié)果顯示無毒劑量的NCE能顯著抑制HBVsAg和HBVeAg的表達，同時也能抑制HBVDNA的復(fù)制。 5）DPP-Ⅳ高通量篩選顯示睡蓮花提取物有一定的降血糖作用。 第三部分新疆圓柏化學(xué)成分及生物活性研究

14、 新疆圓柏Juniperus SabinaL，又名沙地柏，為柏科Cupressaceae常綠匍匐灌木，主要分布于我國的新疆、青海、甘肅等地，藥用果實和枝葉，具有驅(qū)風(fēng)鎮(zhèn)靜、活血止痛之功效，維吾爾族民間用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、小便不利等病癥的治療。本研究通過各種色譜技術(shù)對新疆圓柏新鮮葉進行系統(tǒng)的植物化學(xué)研究，從中分離了23個化合物，采用UV、MS、NMR和2DNMR等波譜技術(shù)及理化手段鑒定了其中的21個化合物，分別為僅α-雪松醇（Ⅲ-1）

15、、園柏香豆素（Ⅲ-2）、異柏油酸（Ⅲ-3）、β-谷甾醇（Ⅲ-4）、鬼臼毒素（Ⅲ-5）、柏木雙黃酮（Ⅲ-6）、柏木雙黃酮4'，4'''-二甲酯（Ⅲ-7）、芹菜素（Ⅲ-8）、穗花杉雙黃酮（Ⅲ-9）、羅漢松雙黃酮A（Ⅲ -10）、槲皮素3-O-β-D-6"-乙酰吡喃葡萄糖苷（Ⅲ-11）、異高黃芩素7-O-β-D-木糖苷（Ⅲ-12）、兒茶素（Ⅲ-13）、楊梅素3-O-β-D-葡萄糖苷（Ⅲ-14）、槲皮素（Ⅲ-15）、蘆丁（Ⅲ-16）、茵芋苷（Ⅲ

16、-17）、undulatoside A（Ⅲ-18）、hypolaetin7-O-β-xylopyranoside（Ⅲ-19）、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷（Ⅲ-20）和紫丁香苷（Ⅲ-21）；其中化合物Ⅲ-7、9～12、14和17～21為首次從該植物中分離得到。體外抗氧化試驗結(jié)果顯示新疆圓柏乙醇提取物及部分化學(xué)成分可有效清除DPPH自由基，具有一定的抗氧化作用。 第四部分黑紫橐吾化學(xué)成分研究 黑紫橐吾Ligularia

17、 atroviolacea為菊科千里光族橐吾屬多年生草本植物，生長于海拔3000-4000米的高山草地之中，廣泛分布于我國云南西北部、四川、貴州、湖北西部和甘肅西南部等地。橐吾屬植物在我國有一百余種，其中有二十余種在民間有藥用記載，具有消炎止痛、止咳祛痰、活血化癖之功效，在民間用于咳嗽、流行性感冒等疾病的治療。本課題組在前期研究基礎(chǔ)上，對產(chǎn)自云南麗江橐吾屬植物黑紫橐吾地上部分乙醇提取物的乙酸乙酯部位進行了化學(xué)成分研究，從中分離得到了4個