應(yīng)用四聚體技術(shù)檢測(cè)肺結(jié)核患者外周血及病變組織C5特異性CD4+T淋巴細(xì)胞.pdf

1、研究背景:
　　結(jié)核病是可侵犯全身組織器官的慢性傳染病，尤其以肺部感染多見，病原體為結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）。隨著卡介苗的普遍接種及抗結(jié)核藥物的應(yīng)用，結(jié)核病的感染率、發(fā)病率和死亡率曾大幅下降。近年來，由于人口流動(dòng)增多、耐藥菌株的流行、結(jié)核菌與人體免疫缺陷病毒（HIV）的雙重感染以及許多國家結(jié)核病控制力度的薄弱，導(dǎo)致全球結(jié)核病疫情回升。機(jī)體的抵抗力，侵入機(jī)體的細(xì)菌數(shù)量，細(xì)菌毒力的大

2、小，共同決定了感染者是否發(fā)病。結(jié)核分枝桿菌屬胞內(nèi)感染菌，機(jī)體的抗結(jié)核免疫主要依靠T淋巴細(xì)胞，特別是以CD4+Thl細(xì)胞為主的細(xì)胞免疫。機(jī)體感染結(jié)核分枝桿菌后，抗原遞呈細(xì)胞（antigen present cells，APCs），主要是單核巨噬細(xì)胞對(duì)其吞噬，加工處理，抗原肽結(jié)合APCs表面的人類白細(xì)胞抗原（human leucocyte antigen，HLA），形成多肽／HLA復(fù)合物，然后被T淋巴細(xì)胞表面的T細(xì)胞受體（T-lymphoc

3、yte receptor,TCR）特異性地識(shí)別并結(jié)合，進(jìn)而介導(dǎo)一系列的免疫反應(yīng)。利用多肽/MHC與TCR的特異性結(jié)合的特性，許多學(xué)者考慮采用免疫標(biāo)記技術(shù)標(biāo)記多肽/MHC去檢測(cè)表達(dá)有TCR分子的多肽特異性T淋巴細(xì)胞。但由于多肽/MHC單體與CD4+T淋巴細(xì)胞的TCR結(jié)合親和力低，解離速度很快，不能直接用來檢測(cè)抗原特異性T淋巴細(xì)胞。1996年，Altman等成功創(chuàng)建了多肽/MHC四聚體技術(shù)，從而大大提高了多肽/MHC復(fù)合物與TCR的親和力和

4、穩(wěn)定性，使這一難題得到解決。
　　目前，多肽／MHC I四聚體己被廣泛用于抗原特異性CTL活性檢測(cè)，而且可應(yīng)用于免疫學(xué)研究和檢測(cè)、免疫治療以及疫苗療效監(jiān)測(cè)。傳統(tǒng)制備MHCI類分子四聚體是用基因工程的方法，先分別制備β2m和可生物素化的重鏈（通過在其C端加上15個(gè)氨基酸的BirA酶底物肽），然后二者和特異性抗原肽共同孵育，形成MHC-肽復(fù)合物單體。經(jīng)過BirA酶作用后，生物素化的MHC-肽復(fù)合物單體與鏈霉親和素按4：l的比例結(jié)合，形

5、成MHCⅠ-肽四聚體。然而，MHCⅡ類分子（DR）是由α鏈和β鏈形成的異二聚體，由于α、β兩條鏈都具有多態(tài)性，體外折疊時(shí)通常不能很好的結(jié)合短肽，因此，制備MHCⅡ類分子的四聚體要復(fù)雜得多。根據(jù)Novak的研究，在α、β鏈的C端連上連接蛋白和亮氨酸拉鏈基序，且β鏈上加上可生物素化的底物肽。經(jīng)大量表達(dá)、分離純化和生物素化后，在體外與高濃度的特異性多肽37℃孵育72小時(shí)，形成多肽/MHCⅡ-肽復(fù)合物，最后與熒光素標(biāo)記的鏈霉親和素結(jié)合形成四聚體

6、。
　　在實(shí)驗(yàn)室前期，已構(gòu)建了16株能分泌表達(dá)不同C5/HLA-DRB1單體的果蠅S2恒定細(xì)胞株，本次實(shí)驗(yàn)研究應(yīng)用了其中2株(C5/HLA-DRB1*090102和C5/HLA-DRB1*130201）。C5是來源于CFP10中的一段氨基酸序列，本實(shí)驗(yàn)室之前的研究通過用ELISPOT等方法已經(jīng)證實(shí)了C5是一種廣譜HLA-DR限制性的CD4+ T淋巴細(xì)胞反應(yīng)性多肽。而HLA-DRB1*090102和HLA-DRB1*130201為H

7、LA-DRB1基因座的兩種不同等位基因序列，分別編碼不同的HLA-DRB1分子。
　　研究目的:
　　1.應(yīng)用已制備的四聚體，結(jié)合激光共聚交顯微鏡在結(jié)核組織中觀察C5特異性CD4+T淋巴細(xì)胞。
　　2.應(yīng)用已制備的四聚體，結(jié)合流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)C5特異性CD4+T淋巴細(xì)胞在結(jié)核患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中的比例。
　　研究內(nèi)容和方法
　　應(yīng)用已有的果蠅S2恒定細(xì)胞株，分別表達(dá)、純化獲得2種生物素化C5/HLA-DR

8、B1（C5/HLA-DRB1*090102和C5/HLA-DRB1*130201）復(fù)合物單體，通過SDS-PAGE和Dot blot進(jìn)行鑒定，證實(shí)為目的單體蛋白后，制備FITC標(biāo)記的四聚體，分別與鼠抗人CD4共染色，對(duì)肺結(jié)核患者的肺組織切片進(jìn)行原位染色，用激光共聚焦顯微鏡觀察C5特異性四聚體陽性CD4+ T淋巴細(xì)胞的分布，以肺炎組織切片作對(duì)照染色；制備成相應(yīng)PE標(biāo)記的四聚體，分別與抗人CD4-FITC共染色，流式細(xì)胞技術(shù)分析檢測(cè)肺結(jié)核患

9、者外周血C5特異性CD4+ T淋巴細(xì)胞，同時(shí)以健康成人及非結(jié)核呼吸道感染患者外周血作為研究對(duì)照，然后采用SSPS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。
　　結(jié)果:
　　1.本實(shí)驗(yàn)通過誘導(dǎo)可分泌表達(dá)生物素化的C5／HLA-DRB1復(fù)合物單體的細(xì)胞株，經(jīng)純化、濃縮得到C5／HLA-DRB1復(fù)合物單體蛋白。經(jīng)過SDS-PAGE鑒定兩種單體蛋白與目的蛋白的分子量大小一致，Dot blot鑒定證實(shí)兩種單體蛋白均為生物素化的αβ

10、鏈的二聚體。2種C5／HLA-DRB1四聚體：l3號(hào)：C5／HLA-DRB1*090102、14號(hào)：C5／HLA-DRB1*130201均為目的蛋白單體。
　　2.應(yīng)用2種四聚體用原位染色來檢測(cè)病理組織切片，可直接觀察到組織中針對(duì)C5特異性CD4+T淋巴細(xì)胞的比例、在組織中的定位及分布情況。觀察整個(gè)肺結(jié)核病變組織切片后均能發(fā)現(xiàn)C5特異性CD4+T淋巴細(xì)胞，而肺炎病理切片對(duì)照中，未發(fā)現(xiàn)C5特異性CD4+T淋巴細(xì)胞。
　　3.應(yīng)

11、用C5/HLA-DRB1*090102四聚體檢測(cè)肺結(jié)核組、非結(jié)核呼吸道感染組和健康成人組的C5特異性CD4+T淋巴細(xì)胞的中位數(shù)分別為0.15％、0.09%、0.03%，而應(yīng)用C5/HLA-DRB1*130201四聚體則分別為0.19%、0.10%、0.04%，肺結(jié)核患者組外周血C5特異性CD4+T淋巴細(xì)胞的中位數(shù)高于對(duì)照組（p﹤0.05），2種四聚體之間的檢測(cè)結(jié)果無顯著性差別（p﹥0.05）。
　　結(jié)論:
　　1．誘導(dǎo)果蠅S