日本血吸蟲期特異性新基因Sj314C10的克隆、表達和功能分析.pdf

1、　　利用RACE技術釣取日本血吸蟲成蟲期特異表達基因ESTs的全長cDNA，以期尋找到新的編碼日本血吸蟲病的診斷抗原或候選分子疫苗。通過分析一系列日本血吸蟲成蟲期特異表達基因的ESTs，篩選其中一條EST設計巢式PCR引物，進行第一次RACE。純化目的條帶，連接克隆載體，轉化宿主菌，篩選陽性克隆測序；將測序結果連接到源序列的EST上；之后進行“電子克隆”得到一新的EST。再以該EST片段設計巢式PCR引物，用相同方法進行第二次RACE，

2、直到序列不再延伸為止。對兩次RACE后連接得到的DNA序列進行生物信息學分析，進行GenBank的注冊。然后，選取其完整開放閱讀框(ORF)設計合成雙酶切位點的引物，進行PCR體外擴增，純化目標條帶。連接到相同酶切的原核表達載體pET28a(+)上，轉化宿主菌E.coliBL21。用IPTG誘導表達，觀察各種條件下對重組菌蛋白表達的影響?；厥盏鞍?，完成表達產(chǎn)物的純化和生物活性研究，并進行蛋白的功能分析。結果表明經(jīng)兩次RACE擴增，獲得了

3、一含完整ORF的全長基因片段，測序及序列分析表明該基因為日本血吸蟲一新基因，GenBank注冊號為AY847290，命名為Sj314C10。對此基因編碼蛋白的結構和功能域分析表明該蛋白氨基酸序列與桿狀病毒凋亡抑制蛋白重復結構域有78﹪的同源性。IPTG誘導該基因的原核表達重組菌，SDS-PAGE發(fā)現(xiàn)大約在50ku位置出現(xiàn)一條表達條帶，而且隨著時間的推移表達產(chǎn)物的量逐漸增大。同時，研究顯示：溫度、IPTG濃度和表達時相的改變對蛋白包涵體可