人HT036基因檢測、功能研究及蛋白表達.pdf

1、深度燒傷常常導致患者發(fā)生增生性瘢痕，臨床表現(xiàn)為色紅、突出和質硬。往往給患者身心帶來嚴重傷害。增生性瘢痕的發(fā)病機制已成為燒傷修復領域研究的重點。 我們在前期研究中選用含4096個人類基因的表達譜芯片對5例增生性瘢痕患者及自身正常皮膚進行差異表達基因的篩選，發(fā)現(xiàn)其中一個基因P311引人注目，它在燒傷病人早期增生性瘢痕組織中表達顯著增高。P311蛋白不屬于任何一種已知蛋白家族，對其功能少有研究。Pan等發(fā)現(xiàn)P311基因可以誘導TGF-

2、β<,1>非依賴的肌成纖維細胞表型樣改變。Fujitani等證實腺病毒介導的P311基因上調可以促進大鼠面神經損傷側軸突再生。為進一步探討P311基因在增生性瘢痕中的潛在分子機制，我們利用酵母雙雜交系統(tǒng)，以融合Gal4 DNA結合域的P311為誘餌蛋白，篩選了成人肝cDNA文庫，獲得了與P311相互作用的候選蛋白HT036。 HT036基因做為一功能未知新基因，其序列由Xu等在2001年首次提交基因庫，編碼一胞內蛋白。為探討HT

3、036基因在增生性瘢痕形成中的可能機制，我們首先檢測了該基因在增生性瘢痕和同體正常皮膚中的表達差異，隨后觀察了HT036基因在成纖維細胞轉分化中的作用，最后在原核表達系統(tǒng)中表達該蛋白，為后續(xù)研究做準備。 研究內容和方法 一、HT036基因在增生性瘢痕和同體正常皮膚中表達差異。 樣本經PBS清洗，提取組織總RNA，通過RT-PCR試劑盒檢測HT036mRNA表達量，為保證RT-PCR在線性范圍，擴增選取30個循環(huán)。

4、采用β-actin為內對照，并用軟件Quantitv One分析表達量。 二、HT036和P311在成纖維細胞轉分化中的作用研究。 通過PCR獲得人HT036編碼基因，經EcoR Ⅰ和SaL Ⅰ雙酶切，克隆至真核表達載體pEGFP-N2，經酶切和測序鑒定正確。人胚肺成纖維細胞株(MRC-5)購自美國ATCC，采用含10％小牛血清、100U/ml青霉素G、100ug/ml鏈霉素DMEM培養(yǎng)。采用Lipofectamine<

5、'TM>2000轉染MRC-5細胞，48小時提取細胞總蛋白，通過Western blot檢測α-SMA和內參GAPDH，并用軟件Quantity One分析表達量。采用同樣的方法轉染293細胞，收集72小時培養(yǎng)上清，用ELIsA檢測纖維化相關指標TGF—β1，MMP-2，MMP-9。 三、HT036蛋白原核表達、鑒定和誘導動力學研究 我們按前述方法構建原核表達載體pE3730a(+)-HT036，經酶切和測序鑒定正確

6、后，重組載體轉化至大腸桿菌DE3(BL21)pLysS菌株。通過IPTG誘導蛋白表達，并用特異性His抗體鑒定，并且對IPTG最佳誘導時間和誘導濃度進行分析。 研究結果 一、HT036基因在增生性瘢痕和同體正常皮膚中表達差異。 3例患者的HT036表達在增生性瘢痕組織中都降低，與同體正常皮膚相比，分別降低70％，75％和46％。 二、HT036和P311在成纖維細胞轉分化中的作用研究。 HT036

7、抑制MRC-5細胞α-SMA表達，而P311誘導其表達。α-SMA相對表達量在空白組、HT036組、P311組和共轉染組分別為0.13，0.03，0.18，0.05。HT036降低293細胞TGF-β 1，MMP-2，MMP-9的分泌。與P311組相比，分別降低46.4％，33％希129％。 三、IIT036蛋白原核表達、鑒定和誘導動力學研究 成功構建了原核表達載體pET30a(+)-HT036，并在大腸桿菌中成功表達。