喉癌細胞系腫瘤側(cè)群細胞的研究.pdf

1、第一部分人喉癌細胞系Hep-2和AMC-HN-8中側(cè)群細胞的檢測和分選
　　目的：探討人喉癌細胞系中是否存在腫瘤側(cè)群細胞及建立可靠的喉癌細胞系側(cè)群細胞(SP細胞)檢測及分選的操作規(guī)程。
　　方法：以人喉癌細胞系Hep-2和AMC-HN-8為研究對象,5μg/mLHoechst33342,150μmol/L維拉帕米,1μg/mL碘化丙啶,應(yīng)用流式細胞技術(shù)檢測細胞系中SP細胞的比例并對Hep-2中SP細胞進行分選并檢測其純度。以

2、含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)SP及non-SP細胞及細胞爬片,觀察細胞活性及培養(yǎng)后細胞形態(tài)。
　　結(jié)果：Hep-2細胞SP比例為17.1±2.0％,AMC-HN=-中sP的比例為11.8±1.7％。經(jīng)維拉帕米處理后比例分別降為0％及0.3±0.1％。流式細胞術(shù)分選Hep-2細胞SP的純度可達99.2±0.2％,non-SP細胞的純度達98.5±0.5％;在含血清培養(yǎng)基中SP及non-SP細胞均貼壁生長,死細胞少,爬片檢查提示均為典型的鱗癌細胞

3、表現(xiàn)。結(jié)論喉癌細胞系中存在SP細胞,能被維拉帕米所抑制,流式細胞技術(shù)可有效的分選SP細胞。
　　第二部分人喉癌Hep-2細胞系中腫瘤側(cè)群細胞生物學(xué)特性
　　目的：通過與non-SP相比較,研究喉癌Hep-2細胞系腫瘤SP細胞的生物學(xué)特性。
　　方法：分選的1×104SP細胞及non-SP細胞以0.2ml無血清培養(yǎng)基種植于同一96孔板上,在1、3、5、7d觀察生長狀態(tài)并用CCK-8法測定細胞的增殖狀態(tài),繪制細胞生長曲線,

4、比較兩組細胞的增殖速度;分選后細胞在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的0、4、8、12d用流式細胞儀動態(tài)測試SP細胞在培養(yǎng)體系中的百分比,以評估其分化能力;分選的1×104SP細胞及non-SP細胞種植于同一96孔板上,培養(yǎng)1天后以2Gy的劑量射線照射,2d后用CCK-8法測定細胞的增殖狀態(tài),計算射線對細胞的抑制率,比較兩組細胞對放射線的耐受性;將1×105,5×104及2×104的SP及non-SP細胞分別注射于8只NOD/SCID鼠的腋窩皮下,8

5、周后觀察成瘤情況,比較兩組細胞的致瘤性。
　　結(jié)果：在無血清環(huán)境下SP細胞及non-SP呈不貼壁、球形、半透明狀,培養(yǎng)后SP細胞漸成簇生長,而non-SP細胞不能形成細胞球;在第1、3、5、7d時SP細胞的吸光度分別為0.665±0.017,1.086±0.069,1.387±1.107,1.675±0.07,而non-SP細胞為0.694±0.0530.951±0.0311.049±0.092,1.008±0.086,除第1d外

6、均具有顯著性差異;分選后SP細胞在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的4、8、12dB寸SP的比例為47.8±1.1％,27.8±3.6％和17.3±1.9％,而non-SP培養(yǎng)后為2.2±0.1％,4.7±0.4％和4.9±0.3％:經(jīng)射線照射后SP細胞與non-SP細胞的抑制率分別為6.7±3.5％和29.9±4.9％(t=14.295,p=.000);細胞數(shù)為5×104,SP與non-SP的成瘤數(shù)分別為7和2(p=0.41),細胞數(shù)為2×104時

7、成瘤數(shù)SP細胞成瘤數(shù)為6,而non-SP不能成瘤(p=0.007)。
　　結(jié)論：Hep-2細胞系中的SP細胞具有很強的增殖、分化、成瘤能力,對射線具有耐受性,證明該SP細胞具有干細胞的相關(guān)特性,它富含腫瘤起始細胞。但同時也說明SP細胞也是不均質(zhì)的,我們不能將SP細胞認為是腫瘤干細胞。
　　第三部分人喉癌Hep-2細胞系腫瘤側(cè)群細胞中干細胞相關(guān)基因的表達分析
　　目的：探討干細胞相關(guān)基因CD133、ABCG2、Bmi1、

8、Notch2及PTEN在SP細胞中的表達。
　　方法：以RealtimePCR檢測SP細胞與non-SP細胞CDl33、ABCG2、Bmi1、Notch2及PTEN在SP細胞中的表達的差異。
　　結(jié)果：CD133、ABCG2、Bmi1及NOTCH2在SP細胞中高表達,而PTEN在SP細胞與non-SP細胞中表達無明顯差異
　　結(jié)論：干細胞相關(guān)基因在SP細胞的形成及維持中可能起重要作用,ABCG2在SP細胞的形成中起重要