Abl基因敲除在調(diào)控血管平滑肌張力中的作用及其機制探討.pdf

1、原發(fā)性高血壓，中風，缺血性心臟病，肺動脈高壓和其他一些心血管疾病是現(xiàn)代化社會主要引起死亡的病因。雖然在臨床研究中已經(jīng)投入巨資，但這些疾病還未能得到解決。而引起上述疾病的重要因素包含血管張力異常，因此對調(diào)節(jié)平滑肌收縮性的因素的研究是目前的熱門課題。平滑肌的收縮是由粗細肌絲之間的相互滑動形成的，在此過程中，構成粗肌絲的肌球蛋白輕鏈磷酸化是啟動粗細肌絲之間滑動的關鍵步驟。早先的認識認為構成細肌絲的肌動蛋白是固定結構，而最近的研究表明，除了肌球

2、蛋白輕鏈磷酸化之外，平滑肌肌動蛋白也處于動態(tài)，肌動蛋白的聚合－解離的過程也在平滑肌張力產(chǎn)生中起重要作用。Abl屬于非受體酪氨酸激酶家族，有證據(jù)表明在非肌肉細胞細胞中，Abl可以通過調(diào)節(jié)肌動蛋白細胞骨架結構而調(diào)節(jié)細胞遷移，伸展，胞緣波動和細胞黏附等活動。而Abl在調(diào)節(jié)平滑肌肌動蛋白骨架結構中的作用及其對于平滑肌張力方面的作用則有待進一步發(fā)掘。 目的:基于上述理論基礎，本研究采用Abl基因敲除小鼠，對其與野生型小鼠的尾動脈血壓，動脈

3、血管平滑肌層厚度，在收縮刺激后的血管平滑肌肌動蛋白結構，肌球蛋白輕鏈磷酸化變化，及Abl下游因子及相關收縮蛋白的表達方面進行研究。探討Abl在平滑肌收縮及細胞收縮骨架蛋白中的作用。 方法和結果: 第1部分、尾動脈血壓測定及血管中層厚度測量。 1. 尾動脈血壓測定。 方法：采用XBP1000型（Kent Scientific公司）無創(chuàng)尾動脈血壓測量系統(tǒng)進行血壓測量。 結果：Abl基因敲除組小鼠的尾動

4、脈血壓較野生型小鼠的尾動脈血壓為低，結果具有統(tǒng)計學意義。 2. 動脈血管中層厚度測量。 方法：取二氧化碳小室安樂死后的小鼠的頸動脈，冰凍切片后以相差顯微鏡拍照，并在專業(yè)軟件下測量動脈中層厚度。 結果：Abl基因小鼠和野生小鼠頸動脈中層管壁厚度相比，差異無統(tǒng)計學意義。 第2部分、收縮刺激后，動脈血管肌球蛋白輕鏈磷酸化檢測和肌動蛋白聚合狀態(tài)檢測。 1. 動脈血管肌球蛋白輕鏈磷酸化檢測分組：a.野生型對

5、照組；b.野生型脫羥腎上腺素刺激組；c.Abl基因敲除型對照組；d.Abl基因敲除型脫羥腎上腺素刺激組。 方法：取二氧化碳小室安樂死后的小鼠的頸動脈，股動脈，主動脈等，以特定濃度脫羥腎上腺素刺激一定時間后以免疫印跡方法測定肌球蛋白輕鏈磷酸化程度。 結果：在脫羥腎上腺素刺激后，Abl基因敲除型小鼠動脈和野生型小鼠動脈肌球蛋白輕鏈磷酸化水平無明顯差異。 2. 動脈血管肌動蛋白聚合狀態(tài)檢測分組：a.野生型對照組；b.野

6、生型脫羥腎上腺素刺激組；c.野生型血管緊張素2刺激組；d.Abl基因敲除型對照組；e.Abl基因敲除型脫羥腎上腺素刺激組；f.Abl基因敲除型血管緊張素2刺激組。 方法：取二氧化碳小室安樂死后的小鼠的頸動脈和腸系膜動脈，以特定濃度脫羥腎上腺素和血管緊張素2刺激一定時間后以免疫熒光方法測定肌動蛋白聚合程度。 結果：經(jīng)以特定濃度脫羥腎上腺素和血管緊張素2刺激后，Abl敲除小鼠動脈血管由刺激引起的肌動蛋白聚合程度較野生型小鼠動

7、脈血管降低，結果具有統(tǒng)計學意義。 第3部分：收縮刺激后Crk相關底物磷酸化水平檢測和收縮相關蛋白表達水平測定。 1. Crk相關底物(CAS)磷酸化水平檢測分組：a.野生型對照組；b.野生型脫羥腎上腺素刺激組；c.野生型血管緊張素2刺激組；d.Abl基因敲除型對照組；e.Abl基因敲除型脫羥腎上腺素刺激組；f.Abl基因敲除型血管緊張素2刺激組。 方法：取二氧化碳小室安樂死后的小鼠的主動脈和腸系膜動脈和股動脈，以

8、特定濃度脫羥腎上腺素和血管緊張素2刺激一定時間后，以免疫印跡方法測定CAS 磷酸化程度。 結果：經(jīng)以特定濃度脫羥腎上腺素和血管緊張素2刺激后，在野生小鼠動脈血管中CAS磷酸化程度增加，而Abl敲除小鼠動脈血管CAS磷酸化增加程度較野生型小鼠動脈血管降低，結果具有統(tǒng)計學意義。 2. 收縮相關蛋白表達水平檢測。 方法：取二氧化碳小室安樂死后的小鼠的主動脈和腸系膜動脈和股動脈及肺組織。以免疫印跡方法測定paxillin

9、，vinculin和肌動蛋白在血管組織中的水平。以定量逆轉錄PCR實驗檢測paxillin，vinculin和GAPDH的mRNA表達水平檢測。 結果：在Abl基因敲除小鼠動脈血管中，paxillin和vinculin蛋白水平較野生型小鼠動脈血管中相應蛋白水平低，并且在Abl基因敲除小鼠肺組織中paxillin和vinculin的mRNA水平也較野生型小鼠動脈血管中相關基因mRNA水平低。 結論: 1. Abl基

10、因敲除小鼠尾動脈血壓較野生型小鼠尾動脈血壓偏低。且Abl基因敲除小鼠和野生型小鼠的頸動脈中層厚度相同，提示Abl不影響平滑肌層的整體結構和厚度。 2. Abl基因敲除小鼠與野生型小鼠相比，其動脈血管在受到收縮刺激后肌動蛋白聚合的增加水平降低，而肌球蛋白輕鏈磷酸化水平則與野生型無明顯差異，提示Abl對于平滑肌張力調(diào)節(jié)是通過影響肌動蛋白細胞骨架結構而發(fā)生作用。 3. Abl基因敲除小鼠與野生型小鼠相比，其動脈血管在受到收縮刺