不穩(wěn)定型心絞痛合并2型糖尿病患者單核細(xì)胞TLR4信號(hào)通路的變化及其調(diào)控機(jī)制.pdf

1、背景和目的：炎癥是動(dòng)脈粥樣硬化和2型糖尿病的共同基礎(chǔ)。冠心病是動(dòng)脈粥樣硬化導(dǎo)致器官病變的最常見類型，2型糖尿病是冠心病的等危癥。不穩(wěn)定性斑塊是導(dǎo)致急性冠脈綜合征（ACS）的病理基礎(chǔ)，而炎癥在斑塊的破裂、血栓形成和局部血管收縮中起極為重要的作用。業(yè)已證明ACS合并2型糖尿病時(shí)，冠脈病變嚴(yán)重，治療效果差，預(yù)后不良，與不伴有糖尿病的患者有明顯的不同，可能與兩者并存時(shí)炎癥加重有關(guān)。因此研究炎癥及其調(diào)控機(jī)制在不穩(wěn)定型心絞痛合并糖尿病中的作用極為重

2、要。 大量研究表明先天性免疫系統(tǒng)和后天獲得性免疫反應(yīng)共同參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)，而其中模式識(shí)別受體在介導(dǎo)先天性免疫中起重要作用，可能是聯(lián)系炎癥與動(dòng)脈粥樣硬化的橋梁。Toll樣受體（TLRs）是重要的先天免疫模式識(shí)別受體，TLR4是TLRs家族中的重要成員，TLR4信號(hào)通路的激活介導(dǎo)了眾多炎癥因子的表達(dá)。TLR4在動(dòng)脈粥樣斑塊的內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞和血管外膜成纖維細(xì)胞表達(dá)均增高，在急性冠脈綜合征患者外周血單核細(xì)胞表達(dá)增高

3、。另外，TLR4通路激活引起的IKK激活和炎癥因子分泌增加介導(dǎo)了胰島素抵抗的發(fā)生，胰島素抵抗是2型糖尿病重要的病理生理基礎(chǔ)，但對TLR4在2型糖尿病患者中的表達(dá)研究較少且結(jié)果不一。我們以往的研究發(fā)現(xiàn)，在不伴有糖尿病的ACS患者外周血單核細(xì)胞中，TLR4存在過度激活，單核細(xì)胞和轉(zhuǎn)錄因子NF-κB進(jìn)一步活化，并產(chǎn)生大量的炎癥因子。TLR4介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成、發(fā)展和破裂中可能具有重要作用。但ACS合并2型糖尿病時(shí)炎癥反應(yīng)的

4、加重是否與TLR4過度激活及TLR4信號(hào)通路的調(diào)控變化有關(guān)，尚不清楚。 研究表明，各種內(nèi)、外源性配體可特異性激活細(xì)胞膜上的TLR4受體，進(jìn)一步通過TLR4/NF-κB信號(hào)通路參與炎癥因子的產(chǎn)生和炎癥反應(yīng)。新近發(fā)現(xiàn)鋅指蛋白A20通過泛素化和去泛素化調(diào)節(jié)參與TLR4/NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控，負(fù)反饋調(diào)節(jié)TLR4信號(hào)。A20由各種刺激如TNF-α、LPS等誘導(dǎo)產(chǎn)生，是NF-κB活化的產(chǎn)物，同時(shí)又可以負(fù)反饋抑制NF-κB的激活，是終止T

5、LR4誘導(dǎo)的NF-κB激活和促炎癥因子表達(dá)所必需的。A20在冠心病、糖尿病以及冠心病合并糖尿病中的表達(dá)如何，尚不明確。 不穩(wěn)定斑塊中激活的單核巨噬細(xì)胞分泌大量的炎癥因子導(dǎo)致斑塊破裂，斑塊中的單核巨噬細(xì)胞主要來自血液循環(huán)，故循環(huán)中的單核細(xì)胞可反映斑塊中單核細(xì)胞狀態(tài)。本研究通過觀察2型糖尿病患者、不穩(wěn)定型心絞痛患者、不穩(wěn)定型心絞痛合并2型糖尿病患者外周血單核細(xì)胞中TLR4、A20及血漿中炎癥因子表達(dá)變化，并在離體實(shí)驗(yàn)中觀察以上患者外

6、周血單核細(xì)胞TLR4信號(hào)通路激活后A20和炎癥因子表達(dá)變化，以及轉(zhuǎn)染A20對該通路的作用。同時(shí)觀察高糖對正常人單核細(xì)胞TLR4通路的影響及藥物（他汀、厚樸酚）干預(yù)作用，探討不穩(wěn)定型心絞痛合并2型糖尿病患者炎癥反應(yīng)的發(fā)生和調(diào)控機(jī)制，為其防治提供理論依據(jù)。 方法和結(jié)果： 第一部分：實(shí)驗(yàn)對象分為四組：對照組（A組）20例，2型糖尿病組（B組）22例，不穩(wěn)定型心絞痛組（C組）18例，2型糖尿病合并不穩(wěn)定型心絞痛組（D組）19例。

7、取外周血采用流式細(xì)胞儀檢測單核細(xì)胞TLR4蛋白的表達(dá)；分離外周血單核細(xì)胞，免疫組化法檢測A20蛋白表達(dá)，Real time RT-PCR檢測TLR4mRNA、A20mRNA表達(dá)；分離血漿，采用ELISA法檢測血漿中促炎因子TNF-α，和抗炎因子IL-10濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者、不穩(wěn)定型心絞痛患者外周血單核細(xì)胞TLR4、A20表達(dá)，血漿TNF-α濃度及TNF-α/IL-10顯著高于對照組。不穩(wěn)定型心絞痛合并2型糖尿病患者上述指標(biāo)高于

8、單純2型糖尿病患者及單純不穩(wěn)定型心絞痛患者。單核細(xì)胞TLR4mRNA和蛋白與FBG、FIN、HOMA-IR、HbAlc、TNF-α、IL-10正相關(guān)。 第二部分：（一）實(shí)驗(yàn)對象分為四組：對照組（A組）12例，2型糖尿病組（B組）15例，不穩(wěn)定型心絞痛組（C組）15例，不穩(wěn)定型心絞痛合并2型糖尿病組（D組）15例。分離外周血單核細(xì)胞，分別用LPS或PBS刺激單核細(xì)胞，用Real time RT-PCR檢測刺激3小時(shí)后單核細(xì)胞TLR

9、4mRNA、A20mRNA表達(dá)，用ELISA法檢測刺激24小時(shí)后細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中TNF-α和IL-10濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)對照組單核細(xì)胞受LPS刺激后TLR4、A20表達(dá)明顯上調(diào)，而不穩(wěn)定型心絞痛患者、2型糖尿病患者及不穩(wěn)定型心絞痛合并2型糖尿病患者單核細(xì)胞LPS刺激后TLR4、A20表達(dá)變化無明顯差異。LPS刺激使單核細(xì)胞TNF-α、IL-10分泌明顯增高，與對照組相比各實(shí)驗(yàn)組單核細(xì)胞分泌TNF-α更多，IL-10較少，TNF-α/IL-

10、10增高。（二）分別將2型糖尿病患者、不穩(wěn)定型心絞痛患者、不穩(wěn)定型心絞痛合并2型糖尿病患者單核細(xì)胞分為空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及A20轉(zhuǎn)染組，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，采用免疫熒光方法檢測GFP報(bào)告基因，免疫組化檢測A20蛋白表達(dá)，Real time RT-PCR檢測外源性A20mRNA表達(dá)。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，予LPS刺激2小時(shí)，免疫組化檢測NF-κBp65蛋白表達(dá)，予LPS刺激24小時(shí)，ELISA法檢測培養(yǎng)上清TNF-α和抗炎因子IL-10濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)A20

11、轉(zhuǎn)染能降低各實(shí)驗(yàn)組LPS刺激后單核細(xì)胞細(xì)胞核NF-κBp65表達(dá)和細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中TNF-α濃度，增加培養(yǎng)上清IL-10濃度，使TNF-α/IL-10降低。 第三部分：分離正常人單核細(xì)胞，用正常糖、高糖單獨(dú)或聯(lián)合阿托伐他汀和厚樸酚刺激48小時(shí)。用Real time RT-PCR檢測單核細(xì)胞TLR4mRNA、A20mRNA表達(dá)，Western blot檢測單核細(xì)胞TLR4、A20蛋白表達(dá)；用正常糖、高糖單獨(dú)或聯(lián)合阿托伐他汀和厚樸

12、酚刺激單核細(xì)胞48小時(shí)后，再用LPS刺激2小時(shí)，用Western blot法檢測NF-κBp65蛋白表達(dá)，刺激24小時(shí)，用ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)物上清液TNF-α和抗炎因子IL-10濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)高糖使單核細(xì)胞TLR4mRNA及蛋白、A20mRNA及蛋白表達(dá)增高，高糖培養(yǎng)的單核細(xì)胞與正常糖培養(yǎng)的單核細(xì)胞相比，LPS刺激后細(xì)胞核NF-κBp65表達(dá)明顯增強(qiáng)，TNF-α分泌增多，IL-10分泌減少。阿托伐他汀、厚樸酚可降低高糖所致的TLR

13、4、A20表達(dá)上調(diào)，降低高糖作用的單核細(xì)胞LPS刺激引起的NF-κBp65表達(dá)增加和TNF-α分泌增加，上調(diào)抗炎癥因子1L-10的分泌。 結(jié)論： （1）不穩(wěn)定型心絞痛、2型糖尿病存在促炎/抗炎失衡。不穩(wěn)定型心絞痛合并2型糖尿病這種失衡更明顯。 （2）單核細(xì)胞TLR4信號(hào)通路參與了不穩(wěn)定型心絞痛、2型糖尿病的炎癥反應(yīng)，與不穩(wěn)定型心絞痛合并糖尿病炎癥反應(yīng)加重有關(guān)。 （3）不穩(wěn)定型心絞痛、2型糖尿病、不穩(wěn)定型心

14、絞痛合并糖尿病時(shí)單核細(xì)胞TLR4表達(dá)上調(diào)，A20上調(diào)不足與炎癥反應(yīng)有關(guān)。 （4）增加A20表達(dá)可降低不穩(wěn)定型心絞痛、2型糖尿病、不穩(wěn)定型心絞痛合并糖尿病單核細(xì)胞TLR4通路過度激活所致的炎癥反應(yīng)。 （5）高糖可通過增加單核細(xì)胞TLR4表達(dá)增強(qiáng)TLR4通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。 （6）他汀類藥物可通過降低單核細(xì)胞TLR4表達(dá)、抑制NF-κB的激活抑制高糖對TLR4信號(hào)通路的影響。 （7）中藥厚樸酚可通過降低單核細(xì)