照射前后不同放射敏感性鼻咽癌細胞CNE1和CNE2中DNA-PK活性與核內(nèi)表達的動態(tài)研究.pdf

1、[目的] 鼻咽癌(Nasopharyngeal Carcinoma，NPC)是一種發(fā)病極具地域特色的惡性腫瘤，由于輻射抗拒導致腫瘤局部未控或復發(fā)是放射治療失敗的主要原因之一。故研究鼻咽癌細胞輻射抗拒機制，尋找敏感的預測指標精確評估疾病及逆轉(zhuǎn)放射抗拒是提高鼻咽癌5年生存率和改善生活質(zhì)量的重要一環(huán)。本項目主要是以DNA-PK為切入點來探討鼻咽癌的放射敏感性。 [研究方法] 1、電鏡觀察鼻咽癌細胞株CNE1(鼻咽高分化

2、鱗癌細胞)和CNE2(鼻咽低分化鱗癌細胞)分化情況；生長曲線法求出兩株細胞的倍增時間，比較增殖差異：集落形成實驗測定CNE1和CNE2不同劑量下的存活分數(shù)，分別用線性二次模型和單擊多靶模型擬合劑量存活曲線并求出放射生物學參數(shù)α、β、2Gy存活分數(shù)(SF2)和D<,0>、D<,q>、N以評價兩株細胞的放射敏感性差異。 2、Signa TECT DNA-Dependent Protein Kinase Assay System試劑盒

3、檢測4Gy照射前后不同時間CNE1、CNE2中DNA-PK的活性變化差異。 3、激光共聚焦檢測不同放射敏感性鼻咽癌細胞株CNE1、CNE2細胞中4Gy照射前后Ku70、Ku80、DNA-PKcs在細胞中的定位改變，探討照射能否引起DNA-PK在這兩株細胞中的核轉(zhuǎn)運。 4、Westem blot檢測照射前后Ku70、Ku80在不同放射敏感性鼻咽癌細胞株CNE1、CNE2細胞中的核內(nèi)表達差異，用scion軟件分析蛋白條帶的光

4、密度值作半定量分析。 [研究結(jié)果] 1、電鏡下：CNE2細胞呈圓或橢圓形，細胞核漿比例大，細胞核大而不規(guī)則，可見多個大核仁；胞漿少量，細胞器較少，可見大量核糖體及糖蛋白，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體少見，細胞呈低分化至未分化形態(tài)。CNE1細胞呈梭形，細胞膜間可見細胞間連接，但未見典型橋粒，細胞質(zhì)內(nèi)可見張力原纖維；細胞核漿比例較小，細胞核仁小，異染色質(zhì)豐富，胞漿內(nèi)可見大量核糖體、線粒體也較多，細胞相對于CNE2細胞相對分化較好。

5、 2、CNE2增殖比CNE1快，CNE1細胞接種后經(jīng)過一天的滯留期，從第2天開始到第6天為其指數(shù)生長期，之后緩慢進入平臺期；CNE2細胞接種后經(jīng)過短暫的滯留期后迅速進入指數(shù)生長期，至第5天細胞數(shù)達高峰，之后進入平臺期。CNE1、CNE2的倍增時間分別為21.53h、18.08h，(p>0.05)。 3、CNE1存活曲線明顯比CNE2平坦，CNE1各個劑量點的存活分數(shù)均比CNE2高，線性部分的α比CNE2小(0.323 VS

6、0.704)，D比CNE2大(0.1 VS 0.058)，SF2 CNE1大于CNE2(0.39 VS 0.11)，CNE1、CNE2的D<,0>分別為1.4413和0.4430，D<,q>分別為0.8285和0.6744。即CNE2細胞的內(nèi)在放射敏感性顯著高于CNE1細胞。 4、DNA-PK的活性檢測結(jié)果：CNE1細胞中各個蛋白濃度的DNA-PK的活性均高于CNE2細胞：當?shù)鞍诐舛葹?5ug-200ugR寸，DNA-PK活性隨

7、著蛋白量的增多呈線性上升。取樣25ug時，放射較為抗拒的CNE1細胞中DNA-PK活性較放射敏感的CNE2細胞明顯高(4.137±0.688 VS 0.412±0.128，p<0.05)；4Gy照射后1h～24h，DNA-PK活性均有提高，且CNE1細胞中DNA-PK活性始終較CNE2細胞高。 5、激光共聚焦顯微鏡觀察：鼻咽癌細胞株CNE1/CNE2細胞中，照射前DNA-PKcs、Ku70、Ku80細胞核和細胞漿均有表達，但主要

8、定位于細胞核；4Gv照射可引起DNA-PK蛋白在CNE1/CNE2中發(fā)生明顯的核內(nèi)轉(zhuǎn)運，照射后15min核內(nèi)蛋白表達即有增強，至照射后1-6h核內(nèi)表達最強，12h-24h開始減弱，但還是強表達在細胞核內(nèi)。 6、Western blot結(jié)果顯示：Ku70、Ku80在放射敏感性不同的鼻咽癌細胞CNE1/CNE2均有表達且表達很強，比較兩株細胞總蛋白中Ku的基礎(chǔ)表達無顯著性差異：4Gy照射后蛋白表達水平也無明顯變化。Ku70、Ku80

9、蛋白在細胞漿蛋白中表達在兩株細胞中比較無顯著性差異，而在同一株細胞中，4Gy照射后較照射前明顯減弱，上樣15ug檢測照射后1h后～24h細胞漿中只有微弱Ku蛋白表達： 在細胞核蛋白中，Ku蛋白表達水平4Gy照射后1h開始較照射前則明顯增強，而在兩株細胞中比較也無顯著性差異。 [結(jié)論] 1、CNE1細胞分化較高，CNE2細胞呈極低分化形態(tài)；CNE2細胞的內(nèi)在放射敏感性顯著高于CNE1細胞。 2、CNE1細