HCMV感染人海馬NSCs分化Astrocytes并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、目的：研究人類巨細(xì)胞病毒(HCMV)能否感染體外培養(yǎng)的由人海馬神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)分化成的星形膠質(zhì)細(xì)胞(Astrocytes)，并觀察病毒感染對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，為探討先天性巨細(xì)胞病毒感染致腦發(fā)育異常的機(jī)制提供理論依據(jù)。 方法：體外分離、培養(yǎng)人海馬NSCs，添加血清誘導(dǎo)其定向分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)并利用間接免疫熒光染色方法通過(guò)檢測(cè)其各自的標(biāo)志蛋白進(jìn)行鑒定。然后用HCMV AD169株感染人星形膠質(zhì)細(xì)

2、胞(MOI=1)，鏡下觀察感染后細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，利用間接免疫熒光技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)病毒基因產(chǎn)物-IE蛋白的表達(dá)，采用流式細(xì)胞術(shù)PI染色和細(xì)胞涂片Annexin V-FITC/PI染色法檢測(cè)感染細(xì)胞的凋亡情況。同時(shí)收集感染細(xì)胞的培養(yǎng)液，接種到正常人胚肺二倍體細(xì)胞(MRC-5)中，觀察有無(wú)典型的HCMV致細(xì)胞病變出現(xiàn)。 結(jié)果：體外原代培養(yǎng)的人海馬NSCs以神經(jīng)球的形式懸浮生長(zhǎng)，絕大多數(shù)細(xì)胞都表達(dá)NSCs的標(biāo)記物-巢蛋白(nestin)

3、，誘導(dǎo)其分化后，細(xì)胞高表達(dá)星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物-神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)。HCMV AD169感染星形膠質(zhì)細(xì)胞7天后，細(xì)胞出現(xiàn)腫脹、變大、變圓等典型病變，胞核內(nèi)檢測(cè)到HCMV即刻早期基因的表達(dá)產(chǎn)物-IE蛋白。流式細(xì)胞術(shù)PI單染結(jié)果顯示：MOI=1時(shí)，感染組細(xì)胞凋亡比例為14.72％±5.78％，明顯高于正常對(duì)照組7.59％±2.33％，兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.18，P<0.05)。細(xì)胞涂片Annexin V-FITC/PI

4、染色結(jié)果也顯示，感染組細(xì)胞凋亡比例高于對(duì)照組。收集感染細(xì)胞的培養(yǎng)液并接種到HCMV的完全容許性細(xì)胞-MRC-5中，一周后細(xì)胞也出現(xiàn)上述典型病變，證明HCMV可在星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)增殖、復(fù)制并釋放到胞外。 結(jié)論：(1)在體外培養(yǎng)的由人NSCs分化成的星形膠質(zhì)細(xì)胞中，HCMV AD169能夠建立增殖性感染，該細(xì)胞是HCMV的容許性細(xì)胞。 (2) HCMV感染誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的由人NSCs分化成的星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡，這可能與先天性巨細(xì)胞