α-,1D-腎上腺素受體自身抗體致內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙及T淋巴細(xì)胞增殖的作用.pdf

1、背景：
　　 高血壓(Hypertension,HT)是一種以動(dòng)脈血壓升高為主要特征的全身性疾病，是目前臨床上最常見(jiàn)、最重要的心血管疾病之一。雖然目前在高血壓的發(fā)病機(jī)制和治療方面已經(jīng)取得了巨大的成就，但仍有很多患者的血壓得不到理想的控制，提示在高血壓發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能還有其它因素的參與。
　　 近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，在惡性高血壓、原發(fā)性高血壓和難治性高血壓患者血清中存在有針對(duì)α1-腎上腺素受體細(xì)胞外第二環(huán)(α1-AR-ECⅡ

2、)的自身抗體(α1-AA)，該自身抗體可以使培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率加快，使心肌細(xì)胞膜上L-鈣通道激活。此外，我們的前期工作還觀察到α1-AA可以通過(guò)激活α1-腎上腺素受體增加離體大鼠胸主動(dòng)脈的張力和重要臟器微血管的張力。這些研究強(qiáng)烈提示α1-AA可能與高血壓疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但目前的研究主要聚焦于α1A受體的自身抗體(α1A-AA)，而α1-腎上腺素受體(α1-AR)主要分為α1A、α1B、α1D三種亞型。已有研究發(fā)現(xiàn)，在人和

3、大鼠主動(dòng)脈分布的α1-AR亞型主要是α1D-AR，α1D對(duì)大動(dòng)脈及小動(dòng)脈收縮都起重要作用，參與了高血壓的發(fā)生發(fā)展，所以高血壓患者體內(nèi)α1D受體自身抗體(α1D-AA)的有無(wú)及其與疾病的關(guān)系值得關(guān)注。但目前要解決上述問(wèn)題尚需要完成大量的基礎(chǔ)研究工作。首先，已有的檢測(cè)α1-AA的試劑盒是用于檢測(cè)抗α1A-AR自身抗體的。因此，建立一種針對(duì)α1D-AR亞型自身抗體的檢測(cè)試劑盒，是進(jìn)行α1D-AA研究所必備的基礎(chǔ)條件。其次，α1D-AA的病理生

4、理意義有待進(jìn)一步確定。本研究小組前期用合成的α1D-AR-ECⅡ肽段主動(dòng)免疫正常大鼠，雖然并未導(dǎo)致高血壓形成，免疫大鼠的血管內(nèi)皮功能發(fā)生了損傷。然而，這種血管內(nèi)皮功能損傷并不能區(qū)別是由于抗原本身的作用，還是由α1D-AA所引起。此外，高血壓發(fā)病過(guò)程中存在免疫系統(tǒng)激活的現(xiàn)象，但原因不清。已知T淋巴細(xì)胞在免疫應(yīng)答起始階段起著必不可少的輔助作用，T淋巴細(xì)胞增殖是機(jī)體對(duì)抗原刺激產(chǎn)生免疫應(yīng)答過(guò)程中的一個(gè)重要階段。有研究表明，T淋巴細(xì)胞膜上存在α1

5、D-AR，那么，α1D-AA除了先前所發(fā)現(xiàn)的對(duì)心血管的作用外，是否可以與T淋巴細(xì)胞膜上的相應(yīng)受體結(jié)合，進(jìn)而影響機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)功能呢?
　　 為了回答上述問(wèn)題，我們?cè)O(shè)計(jì)了本研究課題：(1)根據(jù)ELISA方法的原理，設(shè)計(jì)和研制針對(duì)高血壓患者α1D-AA的抗體測(cè)定試劑盒；(2)將α1D-AA轉(zhuǎn)運(yùn)至正常大鼠，檢測(cè)前期研究觀察到的α1D-AR-ECⅡ主動(dòng)免疫大鼠造成的血管內(nèi)皮損傷等現(xiàn)象是否由α1D-AA所引起；(3)制備高血壓大鼠模型，檢

6、測(cè)模型鼠免疫狀態(tài)，并從離體水平觀察α1D-AA對(duì)T淋巴細(xì)胞的直接作用。
　　 目的：
　　 1.建立并優(yōu)化檢測(cè)α1D-AA的間接酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)測(cè)定方法和條件。
　　 2.觀察α1D-AA長(zhǎng)期被動(dòng)免疫對(duì)大鼠的血壓和血管內(nèi)皮的損傷情況。
　　 3.觀察α1-AA是否可以與T淋巴細(xì)胞膜上的相應(yīng)受體結(jié)合，進(jìn)而影響機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)功能?
　　 研究方法
　　 1.以合成的人α1D-腎上腺素

7、受體(α1D-adrenoceptor,α1D-AR)細(xì)胞外第二環(huán)功能表位肽段(第192-218位氨基酸殘基)為特異性抗原，建立間接ELISA測(cè)定方法，并用該法檢測(cè)100例血壓正常者和69例原發(fā)性高血壓患者血清中抗α1D-AA。
　　 2.用α1D-AA長(zhǎng)期被動(dòng)免疫正常大鼠，觀察該類(lèi)抗體對(duì)大鼠血壓的直接影響；通過(guò)血管環(huán)張力測(cè)定技術(shù)，觀察α1D-AA長(zhǎng)期存在下，大鼠離體胸主動(dòng)脈血管舒縮活動(dòng)的改變；以血清中內(nèi)皮素-1(ET-1)含量

8、為指標(biāo)，觀察在該抗體長(zhǎng)期作用下，血管內(nèi)皮的損傷情況。
　　 3.采用兩腎一夾(2K1C)法制備高血壓大鼠模型，模型成功后，定期檢測(cè)血清中α1D-AA的抗體滴度；并檢測(cè)抗體生成能力；培養(yǎng)腸系膜淋巴結(jié)細(xì)胞，采用CCK-8檢測(cè)試劑盒，觀察α1D AA對(duì)刀豆球蛋白A(Concanavalin A,Con A)刺激的T淋巴細(xì)胞增殖功能的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1.α1D-AA試劑盒的建立及初步應(yīng)用
　　 該實(shí)驗(yàn)

9、方法中確定的最適抗原工作濃度為2.5mg/L，生物素化山羊抗人IgG的工作濃度為1∶1500，SA-HRP的工作濃度為1∶750。
　　 用我們建立的試劑盒，將α1D-AA陽(yáng)性對(duì)照血清和陰性對(duì)照血清重復(fù)測(cè)定20次，其批內(nèi)變異系數(shù)分別為5.8％和4.2％；連續(xù)測(cè)定20天的批間變異系數(shù)分別為12.7％和9.8％，提示本方法具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。
　　 特異性吸收試驗(yàn)結(jié)果表明(圖1-1)，以人工合成的α1D-AR細(xì)胞外第二

10、環(huán)相應(yīng)的抗原肽段吸收陽(yáng)性血清后，使平均OD值下降了2/3；而使用PMT吸收陽(yáng)性血清后，沒(méi)有使該抗體水平下降。提示，本法具有較強(qiáng)的特異性。
　　 用該試劑盒測(cè)定原發(fā)性高血壓患者血清中α1D-AA，其陽(yáng)性率為23.2％(16/69)，明顯高于血壓正常者血清的陽(yáng)性率9％(9/100)，(P＜0.05，表1-2)。
　　 2.被動(dòng)免疫正常大鼠后α1D-AA抗體滴度的變化
　　 給正常大鼠經(jīng)尾靜脈被動(dòng)轉(zhuǎn)入α1D-AA后，大

11、鼠血清中α1D-AA水平迅速升高，隨后保持在一個(gè)較平穩(wěn)的水平。被動(dòng)免疫組1、2、3、4月之間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但和對(duì)照組相比均有顯著差異(均為P＜0.05)。在整個(gè)被動(dòng)免疫過(guò)程中，免疫大鼠血清中α1D-AA水平維持在0.43±0.13～0.49±0.11之間，提示α1D-AA被動(dòng)免疫模型制備成功(圖2-1)。
　　 3.被動(dòng)免疫正常大鼠后血壓的變化
　　 被動(dòng)免疫之前大鼠免疫組和對(duì)照組的平均血壓分別為105±5.4mmH

12、g和104±4.4mmHg，兩者相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞.05)。第2周時(shí)免疫組大鼠血壓有所升高，第4周時(shí)血壓一過(guò)性升高達(dá)125±6.9mmHg，明顯高于免疫對(duì)照組(P＜0.05)，并維持到第6周(125±7.3mmHg)，隨后血壓回落到被動(dòng)免疫前的水平。而免疫對(duì)照組大鼠血壓在整個(gè)免疫過(guò)程中無(wú)明顯變化(圖2-2)。
　　 4.被動(dòng)免疫正常大鼠血清中ET-1的變化
　　 采用ELISA法定量測(cè)定大鼠血清中ET-1的含量。研究

13、結(jié)果顯示，被動(dòng)免疫組大鼠在免疫后4周血清中ET-1含量便開(kāi)始增高(12.0±1.4)，12周時(shí)達(dá)高峰(21.0±1.6)，與對(duì)照組(11.0±1.1)相比有顯著性差異(P＜0.05)。至免疫結(jié)束時(shí)，免疫組ET1仍保持在較高的水平(16.3±0.6)，(P＜0.05，vs.同期對(duì)照組，圖2-3)。提示α1D-AA可能持續(xù)地引起了血管內(nèi)皮損傷。
　　 5.被動(dòng)免疫正常大鼠血管反應(yīng)性的變化
　　 采用離體血管環(huán)的方法測(cè)定大鼠胸

14、主動(dòng)脈的舒縮功能。研究結(jié)果顯示，隨著去氧腎上腺素(PE)濃度的升高，離體大鼠胸主動(dòng)脈血管環(huán)的收縮幅度逐漸增加，在PE濃度為10-7mol/L和10-6mol/L時(shí)，被動(dòng)免疫組大鼠的血管收縮作用較對(duì)照組均增強(qiáng)，兩組相比有顯著性差異(P均小于0.05，圖2-4)；盡管如此，被動(dòng)免疫組大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)皮依賴(lài)性血管舒張功能卻弱于免疫對(duì)照組，當(dāng)Ach濃度為10-6mol/L和10-5mol/L時(shí)，兩組大鼠的血管舒張程度均有顯著性差異(P＜0.05，

15、P＜0.05，圖2-5)。
　　 6.2K1C手術(shù)后大鼠血壓的變化情況
　　 2K1C手術(shù)前手術(shù)組和偽手術(shù)組的血壓分別為114.8±3.9 mmHg和114.3±3.3mmHg；手術(shù)2周后手術(shù)組大鼠血壓升高(134.3±8.7mmHg)，顯著高于同期偽手術(shù)組(116.2±3.9mmHg)(兩組相比P＜0.05)；在術(shù)后4周時(shí)手術(shù)組大鼠血壓達(dá)到高峰(141.5±10.5mmHg)，(P＜0.01，vs.同期對(duì)照組)；并且在

16、術(shù)后16周時(shí)手術(shù)組大鼠血壓仍維持在較高水平(137.6±7.4mmHg，P＜0.01，vs.同期偽手術(shù)組，圖3-1)。提示，高血壓模型制備成功。
　　 7.2K1C手術(shù)后大鼠血清中α1D-AA的生成
　　 2K1C手術(shù)后2周手術(shù)組大鼠血清中α1D-AA含量即升高(0.19±0.02)，顯著高于偽手術(shù)組(0.15±0.01，P＜0.01)；4周后手術(shù)組大鼠血清中α1D-AA含量達(dá)到高峰(0.21±0.01，P＜0.01，v

17、s.同期偽手術(shù)組)；并持續(xù)到第12周(0.21±0.01，P＜0.01，vs.同期偽手術(shù)組)，之后開(kāi)始下降，并于術(shù)后16周降至術(shù)前水平(0.16±0.01，圖3-2)。提示，在高血壓形成過(guò)程中有α1D-AA的生成，并呈一定的規(guī)律性。
　　 8.高血壓大鼠模型中抗體生成能力的改變
　　 采用直接溶血空斑實(shí)驗(yàn)來(lái)測(cè)定兩周時(shí)2K1C大鼠脾淋巴細(xì)胞的功能(即抗體生成能力)，結(jié)果表明，2K1C大鼠直接溶血空斑數(shù)量明顯升高(2.5±0

18、.01，P＜0.01，vs.偽手術(shù)組，圖3-3)。提示，2K1C術(shù)后大鼠在血壓升高過(guò)程中出現(xiàn)免疫系統(tǒng)抗體生成能力的增強(qiáng)。
　　 9.α1D-AA對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖功能的影響
　　 結(jié)論：
　　 1.本研究建立的α1D-AA檢測(cè)的間接ELISA方法具有較強(qiáng)的特異性以及良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。
　　 2.α1D-AA被動(dòng)免疫大鼠，可以引起大鼠血壓一過(guò)性的升高，但并不能導(dǎo)致高血壓的形成。而該抗體長(zhǎng)期存在時(shí)，可以導(dǎo)