miR-483在食管癌發(fā)生中的功能研究.pdf

1、背景：
　　食管癌是世界上第八大常見惡性腫瘤,第六大因癌癥導(dǎo)致死亡的原因。目前全世界有45萬多食管癌患者，并且其發(fā)病率仍在上升。食管癌診斷越早，預(yù)后越好。然而，由于缺乏有效的早期診斷手段，大部分患者首診時(shí)已屆進(jìn)展期，其總的五年生存率僅為15％~25%，因此有必要探索有應(yīng)用價(jià)值的食管癌分子標(biāo)志物和靶分子，從而為食管癌的早期診斷和治療提供線索。
　　microRNAs（miRNAs）是一類在進(jìn)化過程中高度保守的長度在18~25個

2、核苷酸的單鏈非編碼小RNA，主要通過抑制靶基因的翻譯影響人體的各種生理和病理過程。前期我們通過miRNA芯片檢測了25例食管鱗癌及其癌旁組織的差異表達(dá)分子，率先發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了一個食管癌發(fā)生相關(guān)的miRNA分子群。其中，miR-483在食管癌組織中高表達(dá)，但其對食管癌細(xì)胞惡性表型的影響及分子機(jī)制尚未闡明，本課題將對此展開研究。
　　目的：
　　1.檢測miR-483-3p在食管鱗癌細(xì)胞系及正常食管鱗狀上皮細(xì)胞系中的表達(dá)；

3、　　2.構(gòu)建miR-483-3p過表達(dá)和低表達(dá)的食管癌細(xì)胞模型，通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究miR-483-3p對食管癌生物學(xué)行為的影響；
　　3.探討miR-483-3p影響食管癌發(fā)生的分子機(jī)制。
　　方法：
　　1.qPCR檢測miR-483-3p在食管鱗癌細(xì)胞系及正常食管鱗狀上皮細(xì)胞系中的表達(dá)；
　　2.構(gòu)建miR-483-3p的慢病毒表達(dá)載體及空載體，轉(zhuǎn)染食管癌細(xì)胞，建立過表達(dá)miR-483-3p的細(xì)胞模型及相應(yīng)對

4、照細(xì)胞模型；
　　3.合成miR-483-3p inhibitor及inhibitor NC，轉(zhuǎn)染食管癌細(xì)胞，建立低表達(dá)miR-483-3p的細(xì)胞模型及相應(yīng)對照細(xì)胞模型；
　　4.MTT實(shí)驗(yàn)研究miR-483-3p對食管癌細(xì)胞增殖的影響；
　　5.Transwell實(shí)驗(yàn)觀察miR-483-3p對食管癌細(xì)胞遷移的影響；
　　6.流式細(xì)胞儀檢測miR-483-3p對食管鱗癌細(xì)胞周期的影響；
　　7.流式細(xì)胞儀檢

5、測miR-483-3p對食管癌細(xì)胞凋亡的影響；
　　8.MTT法體外藥物敏感性實(shí)驗(yàn)檢測miR-483-3p對食管癌細(xì)胞藥物敏感性的影響；
　　9.裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)觀察miR-483-3p對食管癌細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力的影響；
　　10.通過生物信息學(xué)及全基因組表達(dá)譜芯片聯(lián)合預(yù)測的方法篩選miR-483-3p的靶基因；
　　11.通過qPCR、Western blot及雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-483-3p的靶基因。

6、
　　結(jié)果：
　　1.與正常食管鱗狀上皮細(xì)胞系Het-1A相比，miR-483-3p在食管鱗癌細(xì)胞系EC109、EC9706及TE-1中表達(dá)升高。
　　2.成功建立了過表達(dá)和低表達(dá)miR-483-3p的食管癌細(xì)胞模型。
　　3.上調(diào)miR-483-3p可促進(jìn)食管癌細(xì)胞的增殖、遷移，促進(jìn)細(xì)胞周期由G1期向G2期轉(zhuǎn)化，減少ADR誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，減弱細(xì)胞對化療藥物的敏感性，增強(qiáng)食管癌細(xì)胞的體內(nèi)成瘤能力。
　　4.

7、下調(diào)miR-483-3p可抑制食管癌細(xì)胞的增殖、遷移，導(dǎo)致細(xì)胞周期G1期阻滯，增加ADR誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)細(xì)胞對化療藥物的敏感性。
　　5.通過生物信息學(xué)和全基因組表達(dá)譜芯片聯(lián)合預(yù)測，得到7個miR-483-3p的靶基因：EI24、KLHL12、GRSF1、MKRN1、LEPROTL1、CREBL2、MAPKAPK2。
　　6.上調(diào)食管癌細(xì)胞中miR-483-3p的表達(dá)對以上7個靶基因的mRNA表達(dá)水平無影響。
　　

8、7.上調(diào)食管癌細(xì)胞中miR-483-3p的表達(dá)可導(dǎo)致抑癌基因EI24的表達(dá)下降。
　　結(jié)論：
　　1.與正常食管鱗狀上皮細(xì)胞相比，miR-483-3p在食管鱗癌細(xì)胞系中表達(dá)升高。
　　2.上調(diào)miR-483-3p表達(dá)可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期促進(jìn)食管癌細(xì)胞的增殖、遷移，增強(qiáng)細(xì)胞對化療藥物的耐藥性；下調(diào)miR-483-3p則起到相反的效果。
　　3.miR-483-3p可能通過調(diào)節(jié)EI24等靶基因的表達(dá)影響食管癌的發(fā)生發(fā)展