酒明串珠菌不對稱合成手性醇及其反Prelog脫氫酶的酶學特性研究.pdf

1、光學純的手性醇是化學合成中廣泛應用的重要手性砌塊,其中(R)-和(S)-2-辛醇是合成類固醇、昆蟲性外激素(生物殺蟲劑)等光學活性藥物和農(nóng)藥的中間體,特別是制備高性能液晶及液晶組件不可或缺的原料。利用微生物醇脫氫酶(ADH)對潛手性酮進行不對稱還原制備單一對映體的手性醇是當前手性合成的研究熱點,因其具有立體選擇性好、理論產(chǎn)率高(100％)、環(huán)境友好等的特點。論文以本研究室篩選到的一株不對稱還原2-辛酮生成(R)-2-辛醇的酒明串珠菌Oe

2、nococcus oeni CECT4730為基礎,著眼于工業(yè)化生產(chǎn),以時空產(chǎn)率為目標,采用原位分離技術構(gòu)建了新的水/有機溶劑兩相反應系統(tǒng),對全細胞不對稱制備(R)-2-辛醇進行研究,并對O.oeni CECT4730中起關鍵催化作用的反Prelog規(guī)則(R)-ADH進行了分離純化和酶學性質(zhì)研究。主要工作及取得的結(jié)論如下:
　　 (1)通過比較酒明串珠菌O.oeni CECT4730在6中常見明串珠菌培養(yǎng)基上生長和產(chǎn)(R)-AD

3、H的情況,發(fā)現(xiàn)ATB培養(yǎng)基為最適的發(fā)酵培養(yǎng)基類型。通過Plackett-Burman試驗選出ATB中對該菌發(fā)酵產(chǎn)酶具有顯著正效應的3個因素,按其重要性依次為:番茄汁、酵母膏、檸檬酸氫二銨。并且發(fā)現(xiàn)ATB培養(yǎng)基中番茄汁濃度較高時,其對O.oeniCECT4730發(fā)酵產(chǎn)(R)-ADH的促進作用比對細胞生長的促進作用更為明顯。通過響應面分析確定了各顯著性影響因素的最優(yōu)水平,從而確定了O.oeni CECT4730發(fā)酵培養(yǎng)基的最適配方為:葡萄糖

4、1％、蛋白胨1％、鹽酸-L-半胱氨酸0.05％、MgSO4·7H2O0.02％、MnSO4·4H2O0.005％、吐溫800.1％、番茄汁23.8％、酵母膏0.52％、檸檬酸氫二銨0.34％,pH4.9。與優(yōu)化前相比,全細胞脫氫酶活力提高了133.4％;菌體細胞量提高了12.8％。
　　 (2)通過搖瓶靜置發(fā)酵對O.oeni CECT4730發(fā)酵產(chǎn)酶的非營養(yǎng)條件進行了優(yōu)化,確定的最適條件為:種齡36 h,接種量10％,溫度30℃

5、,起始pH4.9,裝液量為200 ml/250ml。以7 L發(fā)酵罐進行發(fā)酵放大試驗,發(fā)現(xiàn)接種前充入CO2形成厭氧環(huán)境更有利于該菌的生長和產(chǎn)酶,該菌對剪切力敏感,最適攪拌轉(zhuǎn)速為50 r/min,與搖瓶靜置發(fā)酵相比,發(fā)酵周期縮短了約4 h,全細胞脫氫酶活力(12.91 U vs12.84 U)和菌體細胞量(OD600)(1.597 vs1.574)均有一定程度的提高。
　　 (3)運用原位分離技術構(gòu)建了適合O.oeni CECT47

6、30全細胞催化反應的新的TisHCl/正壬烷兩相反應系統(tǒng)。通過對搖瓶反應中的限制性因素的考察,發(fā)現(xiàn)VaVo(v/v)、pH、溫度、搖床轉(zhuǎn)速、輔助底物及底物濃度等均能對反應產(chǎn)率和反應初速度產(chǎn)生明顯影響,而只有pH和溫度能對產(chǎn)物ee值產(chǎn)生影響。在最適反應條件下(VaVo1∶1、pH8.0、溫度30℃、搖床轉(zhuǎn)速150 r/min、輔助底物葡萄糖和細胞用量比5.4:1(m/m)、細胞和底物的用量比0.51∶1(g/mmol)),當?shù)孜餄舛冗_到0

7、.94 mol/L時,反應24 h,時空產(chǎn)率的最大值比前期的研究提高了26.3％,達24 mmol/L·h,產(chǎn)物的ee(R)＞98％。
　　 (4)從2 L發(fā)酵液中約11 g濕菌體開始目的酶的純化,經(jīng)超聲波破碎細胞、硫酸銨鹽析、Q-Sepharose-FF陰離子柱層析、Sephacryl S-200凝膠柱層析后,得到約0.36 mg電泳純的(R)-ADH,活力為254.5U/mg,酶活收率為2.4％,純化倍數(shù)約25.6倍。純酶的

8、催化反應遵循反Prelog規(guī)則,還原2-辛酮得到的產(chǎn)物的ee(R)達到98.9％。
　　 (5)該酶的主要酶學性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn):其分子量為100 kDa(±10 kDa),亞基分子量49 kDa(±2 kDa),為雙亞基結(jié)構(gòu)。最適pH為8.0,最適溫度為30℃,均與全細胞催化反應的最適條件一致。Pb2+,Ag+,和Hg2+對其活力有較大的抑制作用;Fe3+,Cu2+和Zn2+次之。其底物選擇性按2-己酮＜2-庚酮＜苯乙酮＜2-辛酮的