烏鱧胰蛋白酶的分離純化、性質(zhì)分析及分子克隆.pdf

1、胰蛋白酶(Trypsin，EC3.4.21.4)是絲氨酸蛋白酶家族中的一種重要的肽鏈內(nèi)切酶，能專一水解由賴氨酸 Lys)和精氨酸(Arg)的羧基與其他氨基酸的氨基形成的肽鍵，在魚體的生命代謝中具有重要的生理生化功能。目前，國內(nèi)外已經(jīng)報(bào)道了很多海水魚類胰蛋白酶的研究，但是對于淡水魚的報(bào)道卻相對較少，而烏鱧是我國一種非常重要的經(jīng)濟(jì)魚種，胰蛋白酶的生理功能對于該魚的養(yǎng)殖和利用有著重要的意義。但是，迄今為止，該魚中的胰蛋白酶的研究還未見報(bào)道。本

2、課題以烏鱧為研究對象，對其胰臟中的胰蛋白酶進(jìn)行分離純化、性質(zhì)分析，并克隆得到胰蛋白酶原基因的全長序列，為今后研究魚類胰蛋白酶的生理生化功能、飼料加工以及胰蛋白酶在工業(yè)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　 本課題通過硫酸銨鹽析、柱層析(DEAE-Sepharose陰離子交換層析、Sephacryl S-200凝膠過濾層析和Hi-Trap Capto-Q強(qiáng)陰離子交換層析)等方法純化得到兩種胰蛋白酶(胰蛋白酶A，Trypsin A及胰蛋白酶B

3、，Trypsin B)。SDS-PAGE表明兩種胰蛋白酶都得到高度純化。胰蛋白酶A、B的分子量均為22 kDa。肽指紋圖譜結(jié)果顯示，純化的兩種酶均為胰蛋白酶，胰蛋白酶A得到含有25個(gè)氨基酸殘基的2條肽段，胰蛋白酶B得到含有38個(gè)氨基酸殘基的3條肽段，它們與紅鰭東方鲀胰蛋白酶原氨基酸序列完全比對。以熒光底物Boc-Phe-Ser-Arg-MCA為底物測得胰蛋白酶A和胰蛋白酶B的最適溫度均為40℃，最適pH值均為9.0。兩種胰蛋白酶的活化能

4、分別為24.65 kJ·M-1和22.27 kJ·M-1。熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明純化的胰蛋白酶在45℃以下孵育20分鐘后酶的活性仍比較穩(wěn)定，在50℃以上酶的活性急劇降低，酶表現(xiàn)不穩(wěn)定。兩種胰蛋白酶在40℃時(shí)的半衰期大約為60分鐘，說明胰蛋白酶在最適溫度下較容易發(fā)生自身降解導(dǎo)致酶失活。pH穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明兩種胰蛋白酶在pH值為7.0-10.0時(shí)能較好地保持其活性，在酸性環(huán)境中胰蛋白酶活性不穩(wěn)定，酶較容易失活。抑制劑實(shí)驗(yàn)表明絲氨酸蛋白酶類抑制劑，如

5、MBTI、Pefabloc SC、PMSF、LBTI和Benzamidine等，能強(qiáng)烈抑制所純化的胰蛋白酶A和胰蛋白酶B。金屬蛋白酶抑制劑和半胱氨酸蛋白酶抑制劑也能部分抑制胰蛋白酶的活性，說明在胰蛋白酶活性中心附近有金屬離子或者半胱氨酸殘基存在。這些結(jié)果表明純化的兩種蛋白酶均為胰蛋白酶。低濃度的Ca2+能增強(qiáng)酶的活性，而高濃度的Ca2+和其他金屬離子都會不同程度地抑制胰蛋白酶的活性。底物特異性實(shí)驗(yàn)表明所純化的兩種胰蛋白酶均對胰蛋白酶類特

6、異性底物有較強(qiáng)的分解能力，且對底物Boc-Phe-Ser-Arg-MCA的分解能力最強(qiáng)，對其他蛋白酶類底物都不分解。胰蛋白酶A對底物P1位為Arg的底物分解較強(qiáng)，而胰蛋白酶B對底物P1位為Arg和Lys的底物分解作用均較強(qiáng)，當(dāng)?shù)孜颬1位均為Arg而P2位或P3位氨基酸殘基不同時(shí)，胰蛋白酶對底物的分解作用也是不同的，可見，P2位和P3位的氨基酸也能影響酶對底物的分解。底物特異性實(shí)驗(yàn)說明兩種胰蛋白酶在食物消化過程中發(fā)揮不同的作用。通過對特異

7、性的底物進(jìn)行動力學(xué)參數(shù)研究，以Boc-Phe-Ser-Arg-MCA為底物，兩種胰蛋白酶的Km分別為1.020和0.663μM，kcat分別為148和116 S-1，催化效率kcat/Km分別為144.7和174.9 S-1/μM，由此得出胰蛋白酶B對底物的催化效率高于胰蛋白酶A。
　　 結(jié)合肽指紋圖譜結(jié)果并以胰蛋白酶保守位點(diǎn)為依據(jù)設(shè)計(jì)引物，采用5’-RACE、3’-RACE和RT-PCR方法，克隆得到一條916 bp的cDNA

8、，編碼247個(gè)氨基酸，該基因序列的GenBank登錄號為JN558641，相應(yīng)的氨基酸序列GenBank登錄號為AEM91638。該cDNA序列包括一個(gè)9 bp的5’-非編碼區(qū)，744 bp的開放閱讀框和163 bp的3’-非編碼區(qū)。氨基酸序列中包含一段15個(gè)氨基酸殘基的信號肽和9個(gè)氨基酸殘基的酶原激活肽(TAP)，成熟的胰蛋白酶氨基酸序列包含223個(gè)氨基酸殘基，成熟胰蛋白酶的理論分子量約為24.45 kDa，其中His-64、Asp-

9、107和Ser-201構(gòu)成胰蛋白酶的催化三聯(lián)體，該胰蛋白酶含有在脊椎動物胰蛋白酶氨基酸序列中保守的12個(gè)Cys殘基，可以形成六個(gè)二硫鍵。通過分析胰蛋白酶原的氨基酸組成發(fā)現(xiàn)，含量最高的為絲氨酸(35個(gè))，占氨基酸總量的14.2%，其次為甘氨酸(23個(gè))，占氨基酸總量的9.3%。通過對胰蛋白酶原的酶切位點(diǎn)進(jìn)行分析可知，烏鱧胰蛋白酶原含有16個(gè)胰蛋白酶的酶切位點(diǎn)和22個(gè)胰凝乳蛋白酶的酶切位點(diǎn)，且酶切幾率大于80%的分別有14個(gè)和17個(gè)，這說明