利用逆向脂肪酸β-氧化合成中長鏈聚羥基脂肪酸酯.pdf

1、聚羥基脂肪酸酯(PHA)因具有很多優(yōu)良的性能，而被作為一種生物材料應(yīng)用于醫(yī)藥等很多領(lǐng)域。它是一類碳源和能源的貯藏材料，它們在碳源過剩、其他大量元素(N、O、P、S)被耗盡的情況下，可以由一大類種類各異的微生物合成。PHA是由含有不同碳鏈長度的單體即3-羥基脂肪酸(3-hydroxyalkanoate，3HA)聚合而成的。
　　隨著目前追求“綠色聚合物”的潮流日益興盛，PHA作為一類生物可降解，具有生物兼容性的環(huán)境友好型材料，已經(jīng)被

2、用來作為石油基塑料的替代品，而引起廣泛的研究興趣。因為人們對原油價格不斷攀升越來越關(guān)注，加之石油資源的耗盡和由塑料造成的環(huán)境污染越來越嚴重，PHA的生產(chǎn)與合成就越來越受到研究者和工業(yè)領(lǐng)域的關(guān)注。目前為止，已經(jīng)有超過150種的PHA單體組成得以報道。
　　大腸桿菌作為一種模式生物，已經(jīng)被廣泛用來生產(chǎn)各種為人類所用的高附加值產(chǎn)品，如生物燃料、生物材料、大宗化學品等。盡管自然條件下，大腸桿菌無法合成PHA，但是大腸桿菌仍然被認為是PHA

3、合成的理想宿主。用于合成PHA的結(jié)構(gòu)相關(guān)碳源即脂肪酸，一般說來，都是高成本，對細胞有毒性，且不溶于水的。因此，很多研究學者們都開始致力于通過整合不同生物體的基因，去發(fā)現(xiàn)利用非相關(guān)碳源合成PHA的新的代謝途徑。
　　根據(jù)單體中所含的碳原子組成數(shù)目的不同，PHA可以被分成三種主要的類型:1.短鏈長的PHA即scl-PHA，含有3-5個碳原子;2.中鏈長的PHA即mcl-PHA，含有6-14個碳原子;3.短-中鏈長都含有的PHA即scl

4、-mcl PHA，含有3-14個碳原子。
　　根據(jù)PHA的性質(zhì)，可以在醫(yī)學領(lǐng)域發(fā)揮很大的潛能，如在整形醫(yī)學方面，可以作為螺絲，軟骨組織工程支架，骨移植的替代物。在心血管醫(yī)學方面，可以作為系統(tǒng)裝置如血管替代物、心臟瓣膜、心血管支架、心房和心包間隔的修復補丁。在創(chuàng)傷管理方面，可以用作皮膚的替代物、手術(shù)縫合線、醫(yī)用敷料、隔離劑等。除上述一系列功用之外，PHA還可以作為泌尿支架、納米或微球用以控制藥物的傳遞。
　　既然PHA具有這么

5、廣泛而重要的應(yīng)用，因此我們更要構(gòu)建新的PHA高效合成平臺，使其能夠利用廉價碳源高產(chǎn)含不同鏈長、不同類型單體的PHA，以適應(yīng)不同應(yīng)用領(lǐng)域的需求。
　　傳統(tǒng)的scl-PHA如PHB生產(chǎn)應(yīng)用的是三步法，產(chǎn)量較高，已經(jīng)用于大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。而mcl-PHA的生產(chǎn)主要是通過脂肪酸β-氧化和脂肪酸從頭合成途徑實現(xiàn)的。這兩個途徑分別有自己的合成缺陷，脂肪酸β-氧化途徑是以脂肪酸為碳源來合成PHA。而脂肪酸是一種較昂貴的碳源且對微生物細胞有毒害

6、作用，因此利用該途徑合成PHA具有很大的限制。而脂肪酸從頭合成途徑雖然是利用碳水化合物為碳源生產(chǎn)PHA，但是細胞內(nèi)積累的PHA含量較低?；谏鲜龅脑?，迫切需要構(gòu)建一個利用廉價、不相關(guān)碳源高效生產(chǎn)PHA的平臺，從而提供充足的(R)-3-羥酰基-CoA底物。
　　本研究著眼于解決上述問題，在重組大腸桿菌中構(gòu)建了逆向脂肪酸β-氧化循環(huán)中所需酶的過表達質(zhì)粒，試圖直接利用葡萄糖為碳源，通過構(gòu)建的逆向脂肪酸β-氧化循環(huán)，合成含有不同單體的m

7、cl-PHA共聚物。當在單敲除硫脂酶基因的菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加30gl-1葡萄糖時，敲掉tesB基因的菌株合成的mcl-PHA含量最高，占細胞干重的4％左右;敲除ciA基因的菌株次之，約占細胞干重2％;敲除tesA基因的菌株合成的mcl-PHA含量最低。同時，我們嘗試利用其它廉價、非相關(guān)碳源如木糖進行搖瓶發(fā)酵試驗。結(jié)果表明，以30 g l-1木糖為唯一碳源時，三種單敲除硫脂酶基因的菌株在轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pQQ05后，均能合成mcl-PHA，產(chǎn)

8、量最高為2.33 wt％，但低于相應(yīng)菌株以葡萄糖為碳源時的含量。另外，因為在出發(fā)菌株的基礎(chǔ)上，我們敲除了編碼大腸桿菌葡萄糖特異的PTS系統(tǒng)的關(guān)鍵酶即酶ⅡBC的組分基因ptsG，所以解除了大腸桿菌中的碳源代謝阻遏現(xiàn)象，使得葡萄糖和木糖可以同時被利用。因此，我們又在培養(yǎng)基中同時添加15 g l-1葡萄糖和15 g l-1木糖作為碳源，在三種單敲除硫脂酶基因的菌株中轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pQQ05進行搖瓶發(fā)酵試驗，結(jié)果表明三種單敲除硫脂酶基因的菌株均能合成

9、mcl-PHA聚合物，且產(chǎn)量均高于單獨利用木糖為碳源的mcl-PHA合成量。
　　為了進一步提高產(chǎn)量，本研究在重組大腸桿菌中同時敲除了兩個硫酯酶基因，得到雙敲除菌株。在LZ05(ΔtesBΔyciA)中轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pQQ05，mcl-PHA含量達到6.62 wt％，在LZ06(ΔtesBΔtesA)中轉(zhuǎn)入相同質(zhì)粒，mcl-PHA含量達到6.28 wt％,而在LZ07(ΔtesBΔyciA)中轉(zhuǎn)入pQQ05積累的mcl-PHA含量最低，

10、約占細胞干重的5％。三種菌的生長狀況良好，細胞干重均在6gl-1以上。
　　為了得到既含短鏈又含中鏈的PHA即scl-mcl PHA，我們用來自Pseudomonas stutzeri1317的低底物特異性PHA聚合酶-PhaC2Ps替換合成mcl-PHA的來自Pseudomonas aeruginosa PAO1的PHA聚合酶-PhaC2Pa，構(gòu)建pQQ06質(zhì)粒。在菌株LZ05中轉(zhuǎn)入pQQ06后，在添加30 g l-1的葡萄糖的

11、情況下，能夠合成占細胞干重約12％的scl-mcl PHA，其中3HB占21.18 mol％和78.82mol％的中鏈單體。該生產(chǎn)途徑可以在經(jīng)過優(yōu)化之后用于工業(yè)化的大規(guī)模生產(chǎn)。
　　上述所有合成的PHA都只是含有偶數(shù)鏈單體的mcl-PHA，且已經(jīng)顯示出理想的物理和機械性能，如果在其中增加奇數(shù)碳鏈單體的組分能夠賦予該種生物材料更高的強度和柔韌性，使其更具有新穎性和實用性。鑒于此，就特別需要構(gòu)建一個高效的PHA生物合成途徑，使其能合成

12、含奇數(shù)碳鏈單體mcl-PHA所需相應(yīng)的奇數(shù)鏈(R)-3-羥酰基-CoA前體。迄今為止，還沒有利用葡萄糖和丙酸在大腸桿菌中積累含有不同長度奇數(shù)碳鏈單體的mcl-PHA的報道出現(xiàn)。出于這個原因，利用廉價碳源，有功能的逆向脂肪酸β-氧化途徑就被用來提供兩個碳原子延伸的?；?CoA分子前體來合成不同奇數(shù)碳鏈長的(R)-3-羥?；?CoA，從而改變僅能添加相關(guān)碳源-奇數(shù)碳脂肪酸生產(chǎn)奇數(shù)碳鏈前體的局面。
　　在本研究中，PHA生產(chǎn)的代謝途徑包

13、括產(chǎn)生偶數(shù)鏈單體和奇數(shù)鏈單體的兩個平行的模塊。我們構(gòu)建了一個能夠利用葡萄糖和丙酸產(chǎn)生從C7到C13奇數(shù)鏈單體的mcl-PHA生產(chǎn)途徑。
　　為了提供奇數(shù)鏈單體的前體，在本研究中又克隆了來自R.eutropha H16的prpP、prpE和pct基因以及來自E.coli MG1655的acs基因。將PCR擴增得到的上述4個基因與載體pBBR1MCS2連接，構(gòu)建了四個質(zhì)粒，即pZQ01，pZQ02，pZQ03和pZQ04。在構(gòu)建奇數(shù)鏈

14、前體供給的工程化途徑中，可以通過丙酸透過酶（PrpP）攝取丙酸。同時，丙酸也可以直接由丙酰-CoA合成酶（PrpE/Acs）激活或通過丙酰-CoA轉(zhuǎn)移酶(Pct)的作用將3-羥基戊酰-CoA單元插入到延伸的聚合物鏈中，最后再由從P.aeruginosa PAO1中克隆的編碼PHA合成酶的phaC2pa將單體聚合生成既含有奇數(shù)鏈單體又含有偶數(shù)鏈單體的mcl-PHA。
　　為了分析基因prpP，acs，prpE和pct對mcl-PHA

15、生產(chǎn)中奇數(shù)鏈單體含量大小的作用，本研究分別共轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pQQ05和pZQ01，pQQ05和pZQ02，pQQ05和pZQ03，pQQ05和pZQ04進入改造的大腸桿菌菌株LZ05中。之所以使用菌株LZ05，是因為其產(chǎn)生偶數(shù)鏈mcl-PHA的含量最高。搖瓶發(fā)酵實驗是在30℃，250rpm的轉(zhuǎn)速條件下，加入30 g l-1葡萄糖和1.5 g l-1丙酸到轉(zhuǎn)化上述組合質(zhì)粒的重組菌株LZ05培養(yǎng)基中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)都能夠積累含有偶數(shù)和奇數(shù)鏈單體的mcl

16、-PHA。與其他三個組合的質(zhì)粒進行比較發(fā)現(xiàn)，菌株LZ05含pQQ05和pZQ03積累mcl-PHA的含量最高。此外，工程化構(gòu)建的含有質(zhì)粒pQQ05和pZQ01的菌株LZ05合成了占細胞干重大約3.21％的mcl-PHA，而且該菌株含有高達11.24 mol％的最高奇數(shù)鏈mcl-PHA單體產(chǎn)量，其中3-羥基庚酸(3HHp)單體含量約占mcl-PHA的6.46 mol％。這些結(jié)果表明，基因prpP，acs，prpE和pct對mcl-PHA的

17、產(chǎn)量具有不同的影響。根據(jù)上述實驗結(jié)果，該菌株仍然沒有足夠的分子起始奇數(shù)鏈單體的形成。
　　為了提高重組大腸桿菌中mcl-PHA的產(chǎn)量和擁有更多的奇數(shù)鏈單體，我們通過構(gòu)建質(zhì)粒pZQ05，pZQ06和pZQ07，重建了mcl-PHA的生物合成途徑。由于過表達prpP時獲得了最高含量的奇數(shù)鏈單體，所以在上述質(zhì)粒中，prpP和acs，prpP和prpE，prpP和pct兩兩基因同時被分別過表達。然后，它們都是與質(zhì)粒pQQ05共轉(zhuǎn)化到菌株L

18、Z05中，形成LZ05(pQQ05，pZQ05)，LZ05(pQQ05,pZQ06)和LZ05(pQQ05，pZQ07)。培養(yǎng)這些菌株之后發(fā)現(xiàn)，它們表現(xiàn)出不同的生長現(xiàn)象和含有不同含量奇數(shù)鏈單體的mcl-PHA積累情況。 LZ05中共轉(zhuǎn)入雙重質(zhì)粒pQQ05和pZQ05時，細胞干重最高可達6.90 g l-1，比用prpP或acs單基因過表達時的菌株高。然而，當LZ05共轉(zhuǎn)入雙重質(zhì)粒pQQ05和pZQ06(或pZQ07)時的細胞干重只達到6