日本乙型腦炎病毒NS4B蛋白與NS3解旋酶的相互作用研究.pdf

1、日本乙型腦炎病毒(JEV)屬于黃病毒科（Flaviviridae）黃病毒屬（Flavivirus），是引起日本乙型腦炎的病原。該病毒能引起人出現(xiàn)明顯的腦炎癥狀，懷孕母豬感染后會(huì)出現(xiàn)高熱、流產(chǎn)、死胎和木乃伊胎，公豬則出現(xiàn)睪丸炎。目前，日本乙型腦炎病毒流行于亞洲25個(gè)國(guó)家或地區(qū)，全世界約有60％的人口生活在日本乙型腦炎病毒的流行區(qū)，日本乙型腦炎病毒帶來的公共衛(wèi)生問題仍然十分嚴(yán)峻。
　　現(xiàn)階段對(duì)JEV復(fù)制過程中復(fù)制復(fù)合體的形成機(jī)制及其作

2、用機(jī)制尚不是十分明確，已知JEV的所有非結(jié)構(gòu)蛋白均參與到復(fù)制復(fù)合體的構(gòu)成，NS3解旋酶能夠解旋雙鏈RNA，而NS4B蛋白是黃病毒中唯一一個(gè)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜內(nèi)外均有較長(zhǎng)片段的一個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白，對(duì)黃病毒復(fù)制復(fù)合體的形成具有關(guān)鍵作用。本研究通過確定JEV NS4B的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，用免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)及GST pull down實(shí)驗(yàn)，對(duì)NS4B膜外區(qū)與NS3解旋酶之間的相互作用進(jìn)行了驗(yàn)證，并驗(yàn)證了過表達(dá)NS4B及NS4B膜外區(qū)蛋白對(duì)JEV復(fù)制的影響。研究的內(nèi)容

3、及結(jié)果如下:
　　1.JEV NS4B蛋白與NS3解旋酶的相互作用
　　通過PCR擴(kuò)增JEV NS4B基因和NS3解旋酶基因，將該基因連接至pcDNA3.1(+)、pcDNA4.0等真核表達(dá)載體上，并通過間接免疫熒光技術(shù)驗(yàn)證其表達(dá)情況。將驗(yàn)證表達(dá)的真核表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞，36h后收集細(xì)胞樣品，利用免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證NS3解旋酶與NS4B蛋白之間的相互作用。結(jié)果表明，NS3解旋酶與NS4B之間確實(shí)存在互作。

4、r>　　2.JEV NS4B蛋白跨膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的的鑒定
　　為確定NS4B蛋白的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，我們采用TMHMM、Tmpred、HMMTOP、SOSUI、PHD、DAS等六種蛋白跨膜區(qū)分析軟件對(duì)JEV NS4B的氨基酸序列進(jìn)行分析，根據(jù)NS4B氨基酸序列的疏水性，確定NS4B蛋白含有5個(gè)疏水區(qū)。依據(jù)軟件分析結(jié)果，對(duì)NS4B蛋白進(jìn)行分段表達(dá)，將5個(gè)疏水區(qū)分別連接至pEGFP-C1載體上，并將其轉(zhuǎn)染至Hela細(xì)胞中，利用間接免疫熒光技術(shù)驗(yàn)證

5、其亞細(xì)胞定位，最終確定NS4B含有三段跨膜區(qū)，其中軟件預(yù)測(cè)的疏水區(qū)1和疏水區(qū)2位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜內(nèi)，并不參與NS4B的跨膜;第118-175位氨基酸是NS4B蛋白的膜外區(qū)，最有可能參與NS3的互作。
　　3.JEV NS4B蛋白膜外區(qū)與NS3解旋酶的相互作用
　　擴(kuò)增JEV NS4B蛋白的膜外區(qū)基因，并將其連接至真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N1上，將該質(zhì)粒與pcDNA3.1(+)-NS3 helicase共轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞中，

6、通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證NS3解旋酶與NS4B膜外區(qū)的相互作用，結(jié)果顯示，NS3解旋酶與NS4B的膜外區(qū)存在相互作用。
　　擴(kuò)增NS4B膜外區(qū)基因，并將其連接至原核表達(dá)載體pGEX-6p-1上，在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)的重組蛋白，通過GST親和層析純化獲得較純的NS4B膜外區(qū)蛋白，采用GST pull down實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證NS4B與NS3解旋酶之間的直接相互作用，結(jié)果顯示，NS3解旋酶與NS4B的膜外區(qū)之間的相互作用是直接作用