hERG基因Q738X突變體的功能檢測.pdf

1、先天性長QT綜合征(long QT syndrome,LQTS)是由于編碼心肌細胞離子通道的基因發(fā)生突變而引起的。目前已發(fā)現13個與LQTS相關的致病基因。我國LQTS患者主要是LQT2。LQT2是因Herg基因發(fā)生突變所致。Berg基因編碼快速激活延遲整流鉀通道(rapid activating delay rectifier K+channel,Ikr),Ikr是心肌細胞動作電位復極期的主要離子通道。最近報道臨床上檢測到了Herg基

2、因的一個新的突變位點Q738X,并且本課題組已經采用全細胞膜片鉗技術及激光共聚焦技術對其功能進行了鑒定,實驗結果顯示單獨轉染Q738X-Herg的HEK-293細胞中記錄不到電流,而Q738X-Herg與WT-Herg按1:1轉染時可以記錄到Berg鉀電流,但電流幅度比單獨轉染相同量WT-Herg的HEK-293細胞降低了一半。通過激光共聚焦技術表明Q73gX-Herg的蛋白滯留在內質網中。得出結論:Q738X-Herg對WT-Herg

3、無顯性負效應,可能是轉運缺陷導致了LQTS。因此本實驗要明確突變體Q738X導致LQTS的具體機制是否與蛋白的組裝和轉運有關。
　　 本實驗利用脂質體介導的方法進行瞬時轉染。轉染的質粒包括:①野生型WT-Herg;②突變型Q738X-Herg;③對照組未轉染的HEK-293細胞。同時利用蛋白印跡分析(Western blot),觀察突變體Q738X蛋白在細胞膜上的表達情況。
　　 另外,本實驗構建了Flag-WT-Her

4、g和Myc-Q738X-Herg載體,然后利用免疫共沉淀檢測野生型與部分突變型亞單位是否能構成四聚體。
　　 Western blot實驗結果表明在轉染Q738X的細胞中只觀察到未成熟Herg蛋白,而轉染WT的細胞可觀察到成熟和未成熟兩種Herg蛋白形式。免疫共沉淀實驗結果顯示Q738X的亞基和野生型Herg的亞基不能結合形成四聚體結構。說明Q738X的突變影響B(tài)erg蛋白的組裝和轉運功能,使到達細胞膜表面有功能的Berg蛋白數