三葉因子3促進人腦膠質(zhì)瘤進展機制研究.pdf

1、目的:
　　TFF3(Trefoil Factor Family3)三葉因子3，是三葉肽家族的成員之一。其分子結(jié)構(gòu)中含有6個高度保守的半胱氨酸殘基，由3個分子內(nèi)穩(wěn)定的二硫鍵連接，形成三葉狀結(jié)構(gòu)域，因此得名。TFF3在生理狀態(tài)下，參與修復(fù)胃腸粘膜的損傷，近些年研究表明:血清中TFF3的含量具有作為臨床對胃癌、肺癌等腫瘤評估及患者預(yù)后標志物的轉(zhuǎn)化前景。雖然有研究報道TFF3高表達狀態(tài)，與胃腸道腫瘤、乳腺癌、食道癌等腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)，但

2、TFF3參與調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤的生物學行為的分子機制尚無報道。
　　本研究以膠質(zhì)瘤細胞系及人膠質(zhì)瘤標本為切入點，確認TFF3在膠質(zhì)瘤中高表達，并通過敲減TFF3證實其功能。隨后，對其上下游調(diào)控機制進行探討。本研究旨在探索膠質(zhì)瘤細胞中TFF3高表達的生物學意義，為臨床膠質(zhì)瘤治療提供具有潛在轉(zhuǎn)化意義新靶點。
　　方法:
　　1.構(gòu)建敲減TFF3、HIF-1α載體質(zhì)粒，慢病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細胞系，利用嘌呤霉素抗性篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株。

3、r>　　2.Western Blot驗證TFF3與HIF-1α在膠質(zhì)瘤細胞及組織標本中蛋白表達水平。
　　3.Transwell小室遷移實驗觀察敲減TFF3及HIF-1α后膠質(zhì)瘤細胞遷移能力變化。
　　4.Transwell小室包備細胞外基質(zhì)膠侵襲實驗，觀察敲減TFF3及HIF-1α后膠質(zhì)瘤細胞突破基質(zhì)膠侵襲轉(zhuǎn)移能力變化。
　　5.免疫組織化學染色觀察TFF3及HIF-1α在膠質(zhì)瘤患者組織標本中表達情況。
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4、.卡方檢驗探究TFF3與HIF-1α在膠質(zhì)瘤標本中免疫組化染色評分相關(guān)性分析。
　　7.組織熒光染色TFF3及HIF-1α，利用共聚焦顯微鏡觀察二者共定位情況。
　　8.雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?，檢測敲減TFF3后，轉(zhuǎn)錄因子HIF-1α的轉(zhuǎn)錄活性變化。
　　9.免疫共沉淀技術(shù)，檢測TFF3與HIF-1α在體相互作用情況。
　　10.實時熒光定量PCR檢測TFF3在膠質(zhì)瘤細胞系中以及腫瘤標本中表達情況。
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5、1.BrdU摻入實驗檢測敲減TFF3及HIF-1α后，膠質(zhì)瘤穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系增殖率的變化。
　　12.流式細胞術(shù)檢測敲減TFF3及HIF-1α后，膠質(zhì)瘤細胞系凋亡率變化。
　　13.裸鼠皮下成瘤實驗驗證敲減TFF3及HIF-1α后，細胞在體增殖及腫瘤體積變化。
　　14.Kaplan-Meier檢驗分析TFF3表達與患者及顱內(nèi)原位荷瘤小鼠的中位生存期變化。
　　結(jié)果:
　　1.TFF3在膠質(zhì)瘤患者組織標本及膠質(zhì)瘤

6、細胞系中，蛋白表達升高。
　　2.TFF3的mRNA在膠質(zhì)瘤患者組織標本及膠質(zhì)瘤細胞系中表達升高。
　　3.TFF3表達高的膠質(zhì)瘤患者生存期較TFF3低表達患者短。
　　4.TFF3促進膠質(zhì)瘤細胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移，抑制其凋亡。
　　5.HIF-1α在膠質(zhì)瘤患者組織標本及膠質(zhì)瘤細胞系中表達上調(diào)。
　　6.TFF3與HIF-1α表達呈正相關(guān)。
　　7.TFF3與HIF-1α在膠質(zhì)瘤細胞系及組織標本中存在共定

7、位。
　　8.TFF3蛋白與HIF-1α蛋白在體內(nèi)存在互相作用。
　　9.TFF3上調(diào)HIF-1α表達，并增強其轉(zhuǎn)錄活性。
　　10.敲低TFF3的膠質(zhì)瘤細胞系，在小鼠顱內(nèi)成瘤后，小鼠的生存期比對照組顯著延長。
　　結(jié)論:
　　在膠質(zhì)瘤中，TFF3可促進腫瘤細胞生長、侵襲轉(zhuǎn)移并抑制其凋亡。TFF3在常氧狀態(tài)下，與HIF-1α存在相互作用，調(diào)節(jié)HIF-1α表達及轉(zhuǎn)錄活性，從而發(fā)揮促進腫瘤進展的生物學作用。在體