重組制備人細胞質谷草轉氨酶及結晶條件研究.pdf

1、碩士學位論文重組制備人細胞質谷草轉氨酶及結晶條件研究StudiesonRecombinantPreparationandCrystallizationConditionofHumanCytoplasmicGlutamateOxaloacetateTransaminase(GOTl)學號：2131星Q80完成日期：至Q!魚生壘目墨Q日大連理工大學DalianUniversityofTechnology大連理工大學碩士學位論文摘要谷草轉氨酶

2、(Glutamateoxaloacetatetransaminase，GOT)主要催化L天冬氨酸和a一酮戊二酸生成L谷氨酸與草酰乙酸的可逆反應，在生物體內的碳和氮的代謝中扮演著重要角色。谷草轉氨酶作為依賴磷酸吡哆醛(Pyridoxal5phosphatedependent，PLP)的酶類，在人體內存在于細胞質和線粒體中，分別稱之為GOTI和GOT2。GOTl被證明是維持胰腺癌細胞氧化還原平衡和癌細胞生長所需的谷氨酰胺碳骨架代謝中的關鍵物

3、質，因此GOTl是抗腫瘤藥物的分子靶標，解析GOTI的結構將有助于設計，選擇抑制癌細胞生長的藥物。(1)GOTl的高純度重組表達與性質分析通過構建表達載體pET22bgotl，重組酶在大腸桿菌BL21(DE3)中進行了可溶性表達。通過HisTrapTMFFcrudecolumn柱層析和HiTrapTMQXL陰離子交換柱層析分離純化得到了高純度蛋白。蛋白比活力為7083U／mg，純化倍數(shù)為1336倍，活力回收率為183％。凝膠排阻色譜表明

4、重組GOTl的聚集形式為二聚體，所形成的二聚體的分子量為66kDa。該酶的最適溫度為37。c，最適pH75。在3545oC，及堿性條件下(pH75～10。0)，酶的穩(wěn)定性較好。純化后的GOTI被Na、K和M92金屬離子輕微的抑制，被Zn2、Mn2、Cu2、Ni2、C02和Ca2金屬離子顯著抑制。(2)GOTl的結晶條件篩選及晶體數(shù)據(jù)解析初始篩選目的蛋白GOTl的晶體的蛋白濃度為5mg／ml，并確定了三個初篩的條件，分別是CrystalS

5、creen試劑盒的No9(02Mammoniumacetate，01MNacitratetribasicdihydratepH56，30％w／vPolyethyleneglycol4000)，Index試劑盒的No42(O1MBISTrispH55，20％w／vPEG3350)，Index試劑盒No43(01MBISTrispH65，25％w／vPEG3350)。經過條件優(yōu)化，最終確定重組GOTl的結晶最佳條件為01MBIS—Trisp

6、H60，21％w／vPEG3350。GOTl的晶體(PDB登錄號：3WZF)通過氣相擴散懸滴法獲得，結構數(shù)據(jù)利用X一射線衍射收集。解析后的晶體分辨率為299A，晶體屬于空間群P43212，晶胞參數(shù)為a=934A，b=934A，c=l074A，n亍薩7=900。(3)谷草轉氨酶的生物信息學分析雖然二種人來源的細胞質谷草轉氨酶在表達載體及結晶條件上采用的方法不同，但二者整體序列的相似度上達95％。晶體3110的100％的殘基位于合理允許區(qū)域