細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)與內(nèi)膜系統(tǒng)

1、第七章 細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)與細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng),第一節(jié) 細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)的涵義與功能 一、細(xì)胞基質(zhì)的涵義 二、細(xì)胞基質(zhì)的功能,第二節(jié) 細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)及其功能 一、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的形態(tài)結(jié)構(gòu)與功能 二、高爾基體的形態(tài)與功能 三、溶酶體的形態(tài)與功能,第三節(jié) 細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的分選與膜泡運(yùn)輸 一、信號(hào)假說(shuō)與蛋白質(zhì)分選信號(hào) 二、蛋白質(zhì)分選的基本途徑與類型 三、膜泡運(yùn)輸 四、細(xì)胞機(jī)構(gòu)體系的組裝,細(xì)胞內(nèi)被膜區(qū),

2、? 細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)（Cytoplasmic matrix)? 細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)（endomembrane system)? 其他被膜包被的細(xì)胞器（線粒體、葉綠體、過(guò)氧化酶體和細(xì)胞核),第一節(jié) 細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)的涵義與功能,?細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)（Cytosol, Cytoplasmic matrix）?細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)的功能,細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)（Cytosol, Cytoplasmic Matrix ）,細(xì)胞質(zhì)基質(zhì):在細(xì)胞中，除去可分辨的細(xì)胞器以外的膠狀物質(zhì)，細(xì)胞的

3、重要的結(jié)構(gòu)成分，其體積約占細(xì)胞質(zhì)的一半。,肝細(xì)胞中細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)和細(xì)胞其他組分的數(shù)目及所占的體積比,一、細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)的涵義,?在細(xì)胞基質(zhì)中，各種復(fù)雜的代謝反應(yīng)是如何有條 不紊地進(jìn)行，各個(gè)代謝環(huán)節(jié)之間又是如何相互關(guān) 聯(lián)、相互制約的？,?數(shù)以千種的生物大分子和代謝產(chǎn)物（或底物）又 是如何定向地轉(zhuǎn)運(yùn)？,?調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、衰老與凋亡等重大生命活 動(dòng)的細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑又是怎么傳遞與整合的？,細(xì)胞基質(zhì),?細(xì)胞液（Cell sap)?透明

4、質(zhì)(Hyaloplasm)?胞質(zhì)溶液(Cytosol)?細(xì)胞基質(zhì)(Cytoplasmic Matrix) ?細(xì)胞基質(zhì)看成是酶溶液?細(xì)胞基質(zhì)很可能是高度有組織的體系,根據(jù)細(xì)胞基質(zhì)中各種生物大分子結(jié)構(gòu)的實(shí)際數(shù)目與相對(duì)大小所繪制的細(xì)胞基質(zhì)結(jié)構(gòu)的示意圖,The microtrabecular lattice（微梁網(wǎng)絡(luò)） of the cytoplasmic matrix in an unextracted cell.,基本概念用差速離

5、心的方法分離細(xì)胞勻漿物中個(gè)組分，先后除去細(xì)胞核、線粒體、溶酶體、高爾基體和細(xì)胞質(zhì)膜等細(xì)胞器或細(xì)胞結(jié)構(gòu)后，存留在上清液中的主要是細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)的成分。生物化學(xué)家多稱之為胞質(zhì)溶膠。 ?主要成分 中間代謝有關(guān)的數(shù)千種酶類、細(xì)胞質(zhì)骨架結(jié)構(gòu)。,細(xì)胞基質(zhì)的成分,?免疫熒光技術(shù)：酵解過(guò)程有關(guān)蛋白結(jié)合在微絲上?原位雜交技術(shù)：mRNA在細(xì)胞中區(qū)域性分布?卵母細(xì)胞中不同的mRNA在細(xì)胞質(zhì)的不同的部位?酵解有關(guān)的酶類，彼此之間以弱鍵結(jié)合在一起形成

6、酶的復(fù)合體，定位在細(xì)胞基質(zhì)的特定部位，催化細(xì)胞的葡萄糖和丙酮酸的一系列反應(yīng)。,細(xì)胞分裂期的細(xì)胞質(zhì)基質(zhì),細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)是一個(gè)高度有序的體系，其中細(xì)胞質(zhì)骨架纖維貫穿在粘稠的蛋白質(zhì)膠體中，多數(shù)的蛋白質(zhì)直接或間接地與骨架結(jié)合，或與生物膜結(jié)合，完成特定的生物學(xué)功能。,細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)與生物化學(xué)等不同的側(cè)面互相結(jié) 合來(lái)研究細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)的特殊的復(fù)雜的結(jié)構(gòu)體系。,在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中，蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間，蛋白質(zhì)與其它大分子之間的相互作用都是通過(guò)非常弱的鍵來(lái)進(jìn)行，并

7、且常常處于動(dòng)態(tài)平衡之中，這種結(jié)構(gòu)體系的維持只能在高濃度的蛋白質(zhì)及特定的離子環(huán)境的條件之下實(shí)現(xiàn)。,細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)與胞質(zhì)溶膠,細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)主要是由微管、微絲和中等纖維等形成的相互聯(lián)系的結(jié)構(gòu)體系，其中蛋白質(zhì)和其它分子以凝聚狀態(tài)或暫時(shí)的凝聚狀態(tài)存在，它與周?chē)娜芤杭粗車(chē)嘀械姆肿犹幱趧?dòng)態(tài)平衡。,胞質(zhì)溶膠的成分是否與細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)周?chē)芤旱某煞窒嗤?Paine把乳膠小球注射到非洲爪蟾的卵母細(xì)胞經(jīng)過(guò)一段時(shí)間之后，取出乳膠小球，用聚丙烯酰胺雙向凝膠電泳技術(shù)

8、分析了滲入乳膠小球中的蛋白質(zhì)成分，并與周?chē)?xì)胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)成分進(jìn)行了比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在所檢測(cè)到的90多種多肽中，80％的多肽未曾擴(kuò)散到乳膠小球中，而結(jié)合在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)上。 另一些實(shí)驗(yàn)表明，mRNA和核糖體也都是結(jié)合在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)上。,用差速離心的方法所獲得的胞質(zhì)溶膠的成分與細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)周?chē)娜芤撼煞钟泻艽蟮牟煌０|(zhì)溶膠中的多數(shù)蛋白質(zhì)，特別是分子量較大的蛋白質(zhì)，可能通過(guò)較弱的次級(jí)鍵直接或間接地結(jié)合在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)的纖維上。,（一）概念,1、經(jīng)典

9、細(xì)胞學(xué):電鏡下，除去可見(jiàn)的細(xì)胞器及其亞微結(jié)構(gòu)以外的細(xì)胞質(zhì)部分稱為細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)。2、細(xì)胞生物學(xué):分級(jí)離心后，除去所有細(xì)胞器和顆粒剩下的清液部分稱為胞質(zhì)溶膠。學(xué)術(shù)爭(zhēng)議:有人認(rèn)為細(xì)胞骨架不屬于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)的范疇，是細(xì)胞器，也有人認(rèn)為細(xì)胞骨架是細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)的主要結(jié)構(gòu)體系，是其他成分錨定的骨架，同時(shí)它們經(jīng)常處于裝配和解聚的動(dòng)態(tài)平衡中，其解聚的亞單位仍保持在液相中。,（二）化學(xué)組成,成分復(fù)雜，不易分析，所以，反映了大部分細(xì)胞生化成分，即是許多細(xì)胞

10、器生化反應(yīng)的底物和產(chǎn)物的運(yùn)輸通道，本身又涉及了幾種細(xì)胞代謝途徑。離心分離中，易發(fā)生混雜和丟失，破碎的細(xì)胞器及液泡內(nèi)含物可能混入可溶相，而另外一些本屬基質(zhì)的物質(zhì)，如可溶性酶又可依附在細(xì)胞器碎片上被分離掉。,1、是進(jìn)行某些細(xì)胞生化活動(dòng)的場(chǎng)所，糖酵解、脂肪酸合成，有些供細(xì)胞自身結(jié)構(gòu)和代謝所需蛋白，如組蛋白、非組蛋白、肌球蛋白，核糖體蛋白都在游離核糖體中合成。2、維持細(xì)胞器穩(wěn)定，提供適宜離子環(huán)境3、供應(yīng)細(xì)胞器內(nèi)發(fā)生反應(yīng)的底物4、對(duì)蛋白

11、質(zhì)修飾選擇性降解和構(gòu)象修正磷酸化與去磷酸化，糖基化，甲基化，?；蕾嚪核貥?biāo)記的蛋白酶體中的蛋白質(zhì)降解途徑熱休克蛋白HSP幫助變性或畸形蛋白質(zhì)重新折疊5、物質(zhì)貯存和運(yùn)輸，如:膜系統(tǒng)和細(xì)胞骨架系統(tǒng)解聚后的物質(zhì)均貯存于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中，被稱為“分子庫(kù)”，當(dāng)需重新組裝時(shí)由此提供元件。,二、細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)的功能,第二節(jié) 細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)（endomembrane system）及其功能,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的結(jié)構(gòu)與功能 高爾基體的形態(tài)結(jié)構(gòu)與功能

12、溶酶體的形態(tài)結(jié)構(gòu)與功能,一、細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)概述,細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)是指細(xì)胞內(nèi)在結(jié)構(gòu)、功能及發(fā)生上相關(guān)的由膜包繞形成的細(xì)胞器或細(xì)胞結(jié)構(gòu)。真核細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)的區(qū)域化（compartmentalization）： ?細(xì)胞骨架纖維為組織者的Cytomatrix形成 有序的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)； ?細(xì)胞內(nèi)的膜相結(jié)構(gòu)—細(xì)胞器（organelles）。,二、細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)的研究方法,1974，諾貝爾獎(jiǎng) A.Claude，發(fā)明分離細(xì)胞器的差速離心

13、技術(shù) de Duve，用離心技術(shù)發(fā)現(xiàn)了溶酶體和過(guò)氧化酶體 G.Palade,研究了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體,?放射自顯影（Autoradiography）?生化分析（Biochemical analysis）?遺傳突變分析（Genetic mutants）,放射自顯影術(shù)（Autoradiography） Secretory pathway identified by Palade et al.,發(fā)現(xiàn)放射性出現(xiàn)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。蛋白質(zhì)合成

14、始于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。,3’ labeling and the immediate autoradiography3’ labeling, 7’ chase, and autoradiography3’ labeling, 120’ chase, and autoradiography,,脈沖追蹤實(shí)驗(yàn)（Pulse-chase experiment）,Label cells with radioisotopesChase w/ cold am

15、ino acidsFind the radioisotope in time course,EM Autoradiography,Introduce radio-labeled membrane precursorsinto the cytosol @ T = 0,,,,,,,,cell,,,,,,Radiolabel in cytosol,Wait 10, 30, 60, 90.. minutes,,,Overlay an em

16、ulsion “sensitive” to radiation,wait,Radiation triggers the formation of silver particleswhich are photon and electron dense,,,EM autoradiography provides the best resolution,,,,Silver Grains corresponding to the appr

17、oximateposition of radio labeled proteins,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,30 min - 1 hr : ER membrane and lumen radio labeled,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,another 30 min - 1 hr : Transport / Shuttl

18、e Vesicles labeled,,,another 30 min - 1 hr : Golgi Membrane & Lumen labeled,another 30 min - 1 hr : Post Golgi Vesicles labeled,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,

19、,,,,,,another 30 min - 1 hr : Plasma Membrane labeled and some radio labeled proteins found in the extracellular space,Palade’s original data,de Duve，G.Palade，分離到了但八只合成和分泌功能的結(jié)構(gòu)。細(xì)胞被破碎，膜碎片形成小囊泡，小囊泡來(lái)自于不同的膜結(jié)合細(xì)胞器(

20、細(xì)胞核、線粒體、質(zhì)膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等)來(lái)自于內(nèi)膜系統(tǒng)的小囊泡稱微粒體（microsome),差速離心分離與功能分析 微粒體(microsomes)分離,,,微粒體的功能研究,微粒體：保留了膜的結(jié)構(gòu)特征, 活細(xì)胞中的生物活性和功能如：高爾基體的囊泡： 1）將蛋白質(zhì)和脂進(jìn)行糖基化修飾的作用 2）分離的特殊蛋白作為抗原制備抗體, 3）制備的抗體與特定的顆粒如金顆粒結(jié)合, 4）通過(guò)免疫電鏡技

21、術(shù)就能夠?qū)τ米骺乖拿高M(jìn)行定位, 5）揭示了高爾基體在復(fù)雜的糖裝配中的具體過(guò)程。,用酵母突變體研究分泌過(guò)程及與分泌相關(guān)的基因揭示了小泡運(yùn)輸過(guò)程。,用突變體研究?jī)?nèi)膜系統(tǒng)的運(yùn)輸作用,Mutagenize cells and allow to grow at permissive temp. (24 ºC).Shift cells to 37 ºC (non-permissive temp.) for severa

22、l hours.Separate cells by density gradient centrifugationPlate the dense cells at 24 ºC.Screen individual colonies for defects in secretion,*permissive vs nonpermissive temperature,,,sec 突變體的5種不同種類,sec4-2 25 &#

23、186;C,sec15-1 after 2 hr @ 37 ºC,Wild typemorphology,Accumulationof vesicles,野生型是分泌正常的酵母,A、B、C、D、E是五類不同的sec基因(secretory genes)突變,代表了蛋白質(zhì)分泌的五個(gè)過(guò)程。A:分泌蛋白不能進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng),B: 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出芽缺陷,C:分泌小泡不能與高爾基體融合:D:高爾基體不能形成分泌泡;E:分泌泡不能與質(zhì)膜融合

24、。,膜結(jié)合細(xì)胞器與內(nèi)膜系統(tǒng),● 膜結(jié)合細(xì)胞器(membrane-bound organelles)或膜結(jié)合區(qū)室(membrane-bound compartments)● 細(xì)胞質(zhì)膜系統(tǒng)(cytoplasmic membrane system)● 內(nèi)膜系統(tǒng)(endomembrane systems),膜結(jié)合細(xì)胞器的種類和功能,真核細(xì)胞膜結(jié)合區(qū)室的主要功能,膜結(jié)合細(xì)胞器在細(xì)胞內(nèi)的分布,內(nèi)膜系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)性質(zhì),主要是由細(xì)胞中三種不同的生化活動(dòng)

25、引起的: ①蛋白質(zhì)和脂的合成活動(dòng): 在動(dòng)物細(xì)胞中主要涉及分泌性蛋白的合成和脂的合成和加工。脂的合成在光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng),而分泌蛋白的合成起始于粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng),完成于高爾基體。②分泌活動(dòng): ③內(nèi)吞活動(dòng)(endocytosis pathway),是分泌的相反過(guò)程, 細(xì)胞將細(xì)胞外的物質(zhì)吞進(jìn)內(nèi)體和溶酶體。,內(nèi)膜系統(tǒng)與蛋白質(zhì)分選(protein sorting),蛋白質(zhì)分選定位的時(shí)空概念 時(shí)間上 蛋白質(zhì)的合成分選有兩種情況: 先合成

26、,再分選 一邊合成一邊分選。 為了適于蛋白質(zhì)分選的時(shí)間上的需要,核糖體在合成蛋白質(zhì)時(shí)就有兩種存在狀態(tài):游離的或與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)合的?？臻g上 包括了細(xì)胞內(nèi)各個(gè)部分, 蛋白質(zhì)合成機(jī)器的線粒體和葉綠體也需要從細(xì)胞質(zhì)中獲取所需蛋白質(zhì)。,蛋白質(zhì)分選定位的空間障礙及運(yùn)輸方式,蛋白質(zhì)定位的細(xì)胞內(nèi)空間部位結(jié)構(gòu),可分為三種類型:①?zèng)]有膜障礙的,如胞質(zhì)溶膠,包括胞質(zhì)溶膠中的細(xì)胞 骨架蛋白和各種酶及蛋白分子；②有完全封閉的膜

27、障礙,如線粒體、葉綠體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、 高爾基體等；③有膜障礙,但是膜上有孔,如細(xì)胞核。,核孔運(yùn)輸(transport through nuclear pore) 跨膜運(yùn)輸(across membrane transport) 小泡運(yùn)輸(transport by vesicles),一、 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的形態(tài)結(jié)構(gòu)與功能,（一）內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的兩種基本類型?粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（rough endoplasmic reticulum，rER）?

28、光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（smooth endoplasmic reticulum，sER）?微粒體（microsome）,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(Endoplasmic eticulum,ER):由封閉的管狀或扁平囊狀膜系統(tǒng)及其包被的腔形成相互溝通的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（rough endoplasmic reticulum，rER） ?多呈扁囊狀,排列較整齊，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與核糖體共同 形成的復(fù)合機(jī)能結(jié)構(gòu), ?主要功能：合成分泌性蛋白和多

29、種膜蛋白 ?分泌細(xì)胞和分泌抗體的漿細(xì)胞中的rRE非常發(fā) 達(dá)，未分化的細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞中較為稀少 ?移位子（translocon）:新合成多肽進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 有關(guān)（Sec61p） ?有20余種與光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)不同的蛋白質(zhì)；,光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（smooth endoplasmic reticulum，sER） ?呈分支管狀或小泡狀，無(wú)核糖體附著。 ?脂質(zhì)合成的場(chǎng)所 ?細(xì)胞不含純粹的RER或SER，它們分別是ER連

30、 續(xù)結(jié)構(gòu)的一部分。 ?與高爾基體結(jié)構(gòu)、功能與發(fā)生上的關(guān)系密切 ?驅(qū)動(dòng)蛋白與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)合 ?肌肉細(xì)胞中的肌質(zhì)網(wǎng)是一種特化的SER，稱為 肌質(zhì)網(wǎng)，可貯存Ca2+，引起肌肉收縮。,（二）ER的功能,? rER的功能? sER的功能,ER是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)與脂類合成的基地，幾乎全部 脂類和多種重要蛋白都是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成的。,rER的功能,主要功能是幫助膜結(jié)合核糖體合成的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)。膜結(jié)合核糖體上合成的蛋白質(zhì)與游離核

31、糖體上合成的蛋白質(zhì)去向是不同的。 ? 蛋白質(zhì)合成 ? 蛋白質(zhì)的修飾與加工 ? 新生肽的折疊與組裝,? 蛋白質(zhì)合成,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上合成的蛋白質(zhì)主要有：①向細(xì)胞外分泌的蛋白、如抗體、激素；②膜整合蛋白,③構(gòu)成內(nèi)膜系統(tǒng)細(xì)胞器中的可溶性駐留蛋白 需要與其它細(xì)胞組合嚴(yán)格分開(kāi)的酶,如溶酶體的各 種水解酶；④需要進(jìn)行修飾的蛋白,如糖蛋白。,糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上核糖體合成的蛋白類型：?膜整合蛋白(transmembrane pr