甘藍類蔬菜的細胞質(zhì)DNA多樣性研究.pdf

1、甘藍類蔬菜(Brassica oleracea L.)屬于十字花科蕓薹屬,包含結(jié)球甘藍、青花菜、花椰菜、球莖甘藍、芥藍、羽衣甘藍、抱子甘藍等七個栽培變種。2006年全國結(jié)球甘藍(Brassicaoleracea var.capitata L.)的種植面積達93.73萬公頃。結(jié)球甘藍雜交種的生產(chǎn)主要利用自交不親和系和雄性不育系兩種途徑,其中雄性不育系包括顯性核基因雄性不育(DGMS)和改良的Ogura蘿卜胞質(zhì)不育(CMS)。但雄性不育系的

2、利用存在胞質(zhì)單一的風(fēng)險。從分子水平研究甘藍變種間和變種內(nèi)的細胞質(zhì)DNA多態(tài)性,為顯性雄性不育系和胞質(zhì)不育系的胞質(zhì)多樣化提供科學(xué)依據(jù),而且對于闡明甘藍各變種的進化路線具有重要意義。
　　 本研究利用甘藍類蔬菜不同變種間和變種內(nèi)材料,以開發(fā)的葉綠體SSR(cpSSR)和線粒體SSR(mtSSR)引物進行多態(tài)性篩選；利用全基因組重測序結(jié)果,全面揭示六份結(jié)球甘藍材料間的細胞質(zhì)DNA多樣性；以獲得的特異SNP或CAPS標(biāo)記進行Ogura

3、CMS不育系或DGMS不育系胞質(zhì)多樣性的驗證。研究結(jié)果如下:
　　 1.利用已公布的擬南芥葉綠體、油菜線粒體全基因組序列,首次開發(fā)出可在結(jié)球甘藍上應(yīng)用的cpSSR和mtSSR引物。分別搜索獲得89個葉綠體基因組SSRs(cpSSRs)、29個線粒體基因組SSRs(mtSSRs),SSR出現(xiàn)頻率分別為1.736 kb／1個SSR、7.650 kb／1個SSR。針對這些SSR設(shè)計cpSSR引物58對、mtSSR引物21對,能在結(jié)球甘

4、藍上應(yīng)用的cpSSR引物32對、mtSSR引物2l對。在32對cpSSR引物中,5對引物在結(jié)球甘藍自交系C300、C322和波里馬油菜N478、N479間有擴增產(chǎn)物多態(tài)性,這些多態(tài)性片段均位于基因內(nèi)含子區(qū)或基因間隔區(qū)。多態(tài)性片段測序結(jié)果顯示單核苷酸A／T重復(fù)數(shù)從8個到13個不等,相似性比較表明C300、N479間的相似性大于兩者與擬南芥之間的相似性。21對mtSSR引物均未在甘藍C300、C322和波里馬油菜N478、N479間檢測到多

5、態(tài)性,表明線粒體DNA的保守程度比葉綠體要高。這些細胞質(zhì)SSR引物在結(jié)球甘藍上的成功應(yīng)用,為甘藍類蔬菜細胞質(zhì)多樣性研究提供了基礎(chǔ)。
　　 2.利用開發(fā)的cpSSR引物進行甘藍類蔬菜不同變種間細胞質(zhì)DNA多態(tài)性篩選,首次獲得了具有變種特異性的葉綠體單核苷酸多態(tài)性(SNP)標(biāo)記,并成功將其轉(zhuǎn)化為dCAPS標(biāo)記。以32對在結(jié)球甘藍上應(yīng)用的cpSSR引物對結(jié)球甘藍、青花菜、花椰菜、芥藍、球莖甘藍等5個不同變種進行標(biāo)記篩選,在聚丙烯酰胺凝

6、膠電泳上沒有獲得擴增產(chǎn)物長度多態(tài)性。對這32對引物的PCR擴增產(chǎn)物進行測序,利用DNAstar軟件比對發(fā)現(xiàn)1個SNP位點,該位點初步呈現(xiàn)變種特異性。為簡便快速鑒定該SNP位點,將其成功轉(zhuǎn)化為衍生的酶切擴增多態(tài)性序列(dCAPS)標(biāo)記-ACP43-93 RsaⅠ。以該dCAPS標(biāo)記對甘藍類蔬菜不同變種的206份材料進行篩選,進一步驗證了該標(biāo)記的變種特異性。全部花椰菜和大部分青花菜為同一單元型,其它甘藍變種為另一單元型,由此推測青花菜和花椰

7、菜的分化時間相對較晚。同時,利用三個甘藍變種的雄性不育回交群體明確了該葉綠體SNP為母性遺傳標(biāo)記。
　　 3.采用Solexa基因組重測序方法,以結(jié)球甘藍02-12新組裝的葉綠體和線粒體基因組全長序列為參考,全面揭示六份結(jié)球甘藍材料(Ogura CMS R1、R2、R3、自交系60Tian、87-534、DGMS87—534)的葉綠體、線粒體基因組DNA序列多態(tài)性。與02-12相比,異源胞質(zhì)雄性不育材料Ogura CMS R1、

8、R2、R3在葉綠體基因組水平上的SNP個數(shù)分別為1010、357、62,在線粒體基因組水平上的SNP個數(shù)分別是630、599、108,這些不育系的SNP數(shù)量在Ogura CMS R1、R2、R3中呈現(xiàn)逐步減少的趨勢,表明異源胞質(zhì)含量越少,胞質(zhì)不育系的應(yīng)用前景就好。與結(jié)球甘藍自交系Bo-1相比,Ogura CMS R3特有的9個葉綠體SNPs、49個線粒體SNPs、3個線粒體插入和缺失變異(InDels),將為今后Ogura胞質(zhì)不育系的進

9、一步改良提供有效的篩選標(biāo)記。在三份結(jié)球甘藍材料B0-1、Bo-7、Bo-8中,各自特有的葉綠體SNP個數(shù)分別為4、21、0,線粒體SNP個數(shù)分別為9、18、2,特有的線粒體InDels個數(shù)分別為0、3、0,表明結(jié)球甘藍變種內(nèi)材料間具有細胞質(zhì)多樣性,為DGMS不育系的胞質(zhì)多樣化提供依據(jù)。
　　 4.以開發(fā)的32對cpSSR和21對mtSSR引物,對兩種可實用的結(jié)球甘藍Ogura CMS不育源CMS R3、CMS HY進行分子鑒別,

10、發(fā)現(xiàn)了在可實用Ogura胞質(zhì)不育源中的胞質(zhì)多樣性。在cpSSR水平上,無法在聚丙烯酰胺凝膠電泳上獲得多態(tài)性,經(jīng)測序僅發(fā)現(xiàn)兩種不育源在ACP9引物上存在SSR重復(fù)數(shù)的變異。在mtSSR水平上,僅mtSSR2引物可以在聚丙烯酰胺凝膠電泳上區(qū)分這兩種不育源,經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)其余5對mtSSR引物的擴增產(chǎn)物上存在9個多態(tài)性差異,其中3個為SSR位點重復(fù)數(shù)的變異。將其中2個可被MseⅠ酶切的多態(tài)性位點轉(zhuǎn)化成CAPS標(biāo)記,分別命名為m92-143 Mse

11、Ⅰ、m1-346MseⅠ。這些標(biāo)記表明CMS HY是一種不同于CMS R3的改良結(jié)球甘藍Ogura CMS雄性不育源。以CMS HY為不育源進行3個優(yōu)良結(jié)球甘藍自交系的轉(zhuǎn)育,現(xiàn)已獲得回交6代、花器官正常、結(jié)實性良好的優(yōu)良雄性不育系。因此通過鑒別兩種可實用的Ogura CMS不育源,發(fā)現(xiàn)了在可實用Ogum胞質(zhì)不育源中的胞質(zhì)多樣性。
　　 5.采用微量花粉回交法,成功獲得替換胞質(zhì)的DGMS-T不育系四份,并進行了胞質(zhì)來源鑒定。以結(jié)球

12、甘藍DGMS不育系微量花粉為父本,以不育系相應(yīng)保持系為母本,雜交后獲得了四份DGMS-T不育系—07-556、07-1005、07-1006、07-1007。田間鑒定表明在DGMS不育系的不育性遺傳、不育穩(wěn)定性、花器官形態(tài)、結(jié)實性、田間植株性狀等方面,胞質(zhì)替換前后并沒有顯著性差異。以DGMS不育源79-399-3及回交父本60Tian間特有的SNP標(biāo)記和CAPS標(biāo)記,驗證了不育系DGMS—T60Tian的胞質(zhì)來源為其回交父本。總之,本研