祖師麻對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞分泌VEGF和表達(dá)HIF-1的干預(yù)作用研究.pdf

1、目的：觀察祖師麻注射液對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7在脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)刺激下分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascularendothelial growth factor,VEGF)及缺氧誘導(dǎo)因子-1(Hypoxia-induciblefactor-1，HIF-1)表達(dá)的影響，探討祖師麻注射液抗血管生成的作用及機(jī)制。 方法 1.分組 小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7經(jīng)培養(yǎng)后，實(shí)驗(yàn)分組

2、如下：(1)祖師麻組7組：給予10μg/ml LPS刺激的同時(shí)，分別加入終濃度為218.7 mg/ml、72.9 mg/ml、24.3 mg/ml、8.1 mg/ml、2.7 mg/ml、0.9 mg/ml、0.3 mg/ml的祖師麻注射液；(2)空白對(duì)照組：無(wú)處理因素；(3)陰性對(duì)照組(LPS組)：?jiǎn)渭?0μg/ml LPS。 2.檢測(cè)方法 2.1 MTT法檢測(cè)巨噬細(xì)胞的增殖 培養(yǎng)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7，

3、96孔板每孔接種1×10<'4>個(gè)細(xì)胞，孵育48 h后，按上述分組進(jìn)行處理。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后依次加入MTT與DMSO，酶標(biāo)儀讀數(shù)測(cè)各孔吸光度值。 2．2 ELISA方法檢測(cè)巨噬細(xì)胞VEGF的含量 24孔板每孔接種5×10<'4>個(gè)細(xì)胞，孵育48 h后，按實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行處理，祖師麻組取2.1中作用較好的3組，祖師麻注射液終濃度分別為218.7 mg/ml、72.9 mg/ml、24.3mg/ml。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集培養(yǎng)

4、液，離心，取上清，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書操作，檢測(cè)巨噬細(xì)胞分泌VEGF的含量。 2．3 Western Blot方法檢測(cè)巨噬細(xì)胞HIF-1蛋白的表達(dá) 以每孔1×10<'6>個(gè)細(xì)胞的密度接種細(xì)胞于6孔板，培養(yǎng)24 h后，按實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行處理，祖師麻組取2．1中作用較好的3組，祖師麻注射液終濃度分別為218.7 mg/ml、72.9 mg/ml、24.3 mg/ml。培養(yǎng)48 h后，RIPA緩沖液溶解細(xì)胞，離心，取上清，進(jìn)

5、行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)；將電泳后的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(Nitroceltulose Blotting Membranes，NC)上；HIlF*1抗體、Ⅱ抗分別與膜孵育；顯影，分析條帶吸光度值。 結(jié)果 1.祖師麻對(duì)巨噬細(xì)胞增殖的影響MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，祖師麻對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率隨著藥物濃度的降低而下降，抑制率從34.04％(祖師麻218.7 mg/ml)下降至2.28％(祖師麻0.3

6、mg/ml)。其中218.7 mg/ml、72.9 mg/ml、24.3 mg/ml劑量祖師麻組的吸光度值分別為0.45±0.06、0.54±0.09、0.57±0.12，與陰性對(duì)照組(LPS組)0.68±0.20相比較有顯著性差異(p<0.05或p<0.01)。而8.1 mg/ml、2.7 mg/ml、0.9 mg/ml、0.3 mg/ml劑量祖師麻組的吸光度值與對(duì)照組相比沒有顯著性差異(P>0.05)。 2.祖師麻對(duì)巨噬細(xì)胞

7、分泌VEGF的影響祖師麻注射液濃度在218.7 mg/ml、72.9 mg/ml和24.3 mg/ml時(shí)均可抑制小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7在10μg/ml脂多糖刺激下分泌的VEGF增多，其VEGF分泌量分別為1029±175 pg/ml、1575±186pg/ml、1550±217 pg/ml，與陰性對(duì)照組(LPS組)1895±155 pg/ml相比較有顯著性差異(p<0.05或p<0.01)。 3.祖師麻對(duì)巨噬細(xì)胞表達(dá)HIF

8、-1的影響Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，祖師麻注射液濃度在218.7 mg/ml、72.9mg/ml和24.3 mg/ml時(shí)均可抑制LPS刺激巨噬細(xì)胞RAW264.7對(duì)HIF-1的表達(dá)，HIF-1的吸光度值分別為1.53±0.10、2.82±0.09、5.89±0.25，與陰性對(duì)照組(LPS組)比較，差異有顯著性意義(p<0.01)。 結(jié)論 祖師麻注射液可抑制小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7分泌VEGF，其機(jī)理與抑制