腺苷受體A1在間歇低氧細胞損害中的作用.pdf

1、目的：
　　阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(obstructive sleep apnea hypopneasyndrome，OSAHS)是兒童常見的一種睡眠紊亂，其主要病理生理機制為慢性間歇性低氧，常引起嚴重的并發(fā)癥，其中最為嚴重的是兒童學習、記憶等認知功能方面的障礙，這對家庭及社會造成了巨大的影響。現(xiàn)已明確認知功能障礙是OSAHS疾病引起了神經(jīng)元細胞損傷引起的，但是引起神經(jīng)元細胞損傷的機制尚不明確。腺苷受體A1(adenosi

2、ne A1 receptor，ADORA1)存在于多個系統(tǒng)，以神經(jīng)系統(tǒng)中的表達水平最高，已有較多研究提出其在加重細胞損傷的過程中起到重要的作用。本研究利用間歇低氧PC12細胞模型、ADORA1激動劑、ADORA1抑制劑及蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)抑制劑，通過細胞計數(shù)試劑盒(cell counting kit，CCK)、Western Blot法、qRT-PCR法、免疫熒光法檢測間歇性低氧處理后PC12細胞存活

3、率的改變及PKC蛋白、磺脲類受體亞基1(sultfonylurea receptor1，SUR1)及內(nèi)向整流鉀通道亞基6.2(inwardlyrectifying potassium channel6.2，Kir6.2)mRNA和蛋白的表達，闡明ADORA1在間歇低氧致細胞損傷中的作用。
　　方法：
　　PC12細胞傳代后隨機分為以下幾組:對照組(Control)、空氣模擬對照組(air control，AC)、持續(xù)低氧組(

4、sustained hypoxia，SH)、間歇低氧組(intermittent hypoxia， IH)、間歇低氧溶劑(二甲基亞砜，dimethylsulfoxide solution，DMSO)對照組(DMSO)、間歇低氧ADORA1激動劑(2-氯環(huán)戊腺苷，2-Chloro-N6-cyclopentyladenosine，CCPA)組(CCPA)、間歇低氧ADORA1抑制劑(1，3-二丙基-環(huán)戊黃嘌呤，8-Cyclopentyl-1

5、，3-dipropylxanthine，DPCPX)組(DPCPX)、間歇低氧PKC抑制劑(白屈菜紅堿，Chelerythrine chloride，CHE)組(CHE)。間歇低氧細胞實驗艙由電腦自動控制通入高純度的O2和N2，5％O260min-20％O230min為一個循環(huán)，共6個循環(huán)，同時維持艙內(nèi)CO2濃度為5％，溫度為37℃。持續(xù)低氧細胞實驗艙通入高純度的O2和N2，5％O2，共6h，維持艙內(nèi)CO2濃度為5％，溫度為37℃。空氣

6、模擬對照艙中，輸入正常的空氣，也維持艙內(nèi)CO2濃度為5％，溫度為37℃。實驗造模結(jié)束后，用CCK-8法測各組細胞活力變化，Western Blot法檢測PKC蛋白的表達，qRT-PCR法測SUR1、Kir6.2 mRNA的表達，免疫熒光法測SUR1、Kir6.2蛋白的表達。
　　結(jié)果：
　　1、CCK-8法檢測細胞活力變化:八組PC12細胞存活率之間差異存在統(tǒng)計學意義(F=55.11，p＜0.01)。其中，與Control組

7、比較，AC組細胞存活率無明顯改變，差異無統(tǒng)計學意義(p＞0.05)，SH組及IH組細胞存活率均較Control組明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（均p＜0.01），其中IH組細胞存活率較SH組下降更為明顯，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.01);與IH組比較，DMSO組細胞存活率無明顯改變，差異無統(tǒng)計學意義(p＞0.05)，CCPA組細胞存活率下降，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)，DPCPX組細胞存活率明顯上升，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.01)，

8、CHE組細胞存活率上升，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。
　　2、Western Blot法檢測PKC蛋白表達量變化:六組PC12細胞PKC蛋白表達量之間差異存在統(tǒng)計學意義(F=36.98，p＜0.01)。其中，與Control組比較， AC組PKC蛋白表達量無明顯改變，差異無統(tǒng)計學意義(p＞0.05)，IH組PKC蛋白量表達明顯上升，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.01);與IH組比較，DMSO組PKC蛋白表達量無明顯改變，差異無統(tǒng)

9、計學意義(p＞0.05) CCPA組PKC蛋白表達量明顯上升，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.01)，DPCPX組PKC蛋白表達量下降，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。
　　3、qRT-PCR法測Kir6.2、SUR1 mRNA表達量變化:七組PC12細胞Kir6.2、SUR1 mRNA表達量之間差異存在統(tǒng)計學意義（F=94.50、73.83，均p＜0.01）。其中，與Control組比較，AC組Kir6.2、SUR1 mRNA表達均

10、無明顯改變，差異無統(tǒng)計學意義（均p＞0.05），IH組Kir6.2、SUR1 mRNA表達均明顯上升，差異有統(tǒng)計學意義（均p＜0.01）;與IH組比較，DMSO組Kir6.2、SUR1mRNA表達均無明顯改變，差異無統(tǒng)計學意義（均p＞0.05），CCPA組Kir6.2、SUR1 mRNA表達均明顯上升，差異有統(tǒng)計學意義（均p＜0.01），DPCPX組Kir6.2、SUR1 mRNA表達均下降，差異有統(tǒng)計學意義(分別p＜0.01及p＜0.

11、05)，CHE組Kir6.2、SUR1 mRNA表達均明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(均p＜0.01)。
　　4、免疫熒光法測Kir6.2、SUR1蛋白表達量表達:七組PC12細胞Kir6.2、SUR1蛋白表達量之間存在差異。與Control組比較，AC組Kir6.2、SUR1蛋白表達均無明顯改變， IH組Kir6.2、SUR1蛋白表達均上升;與IH組相比，DMSO組Kir6.2、SUR1蛋白表達均無明顯改變，CCPA組Kir6.2、