糖尿病誘發(fā)大鼠感覺神經(jīng)病變及其對心肌缺血再灌注神經(jīng)反應(yīng)的生物化學(xué)特征.pdf

1、目的：
　　探討糖尿病大鼠熱痛閾值改變以及支配心臟感覺神經(jīng)細(xì)胞生物學(xué)和 P物質(zhì)(SP)、降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)表達(dá)的改變及其在心肌缺血/再灌注病理性刺激作用下變化特征。
　　方法：
　　(1) II型糖尿病大鼠模型的建立。180-200g雄性SD大鼠16只采用高糖高脂飼料喂養(yǎng)附加小劑量鏈脲佐菌素(STZ,30mg/kg)腹腔注射制作2型糖尿病大鼠(DM組)模型。另外取16只同質(zhì)動物采用普通飼料喂養(yǎng)作為正常對照組(

2、C組)。每周測量一次大鼠的體重和空腹血糖。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)的方法分別測量飼養(yǎng)四周和終末的血清胰島素含量和血清甘油三酯含量。
　　(2) II型糖尿病誘發(fā)大鼠感覺神經(jīng)退化及支配心臟感覺神經(jīng)細(xì)胞對心肌缺血/再灌注神經(jīng)反應(yīng)性的病理改變。實(shí)驗(yàn)中每周測量一次大鼠的甩尾潛伏期。在動物注射STZ10周后將DM組和 C組又分別隨機(jī)分為缺血再灌注組(I/R組)和假手術(shù)組(Sham組)兩個亞組，通過結(jié)扎左冠狀動脈前降支的方法缺血30

3、分鐘再灌注120分鐘制造缺血/再灌注模型，取DM組及C組動物上胸段(T1-T5)背根神經(jīng)節(jié)，采用免疫熒光技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)分別對神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量、分類及 SP和 CGRP的表達(dá)進(jìn)行分析。
　　(3)Ⅱ型糖尿病感覺神經(jīng)病變大鼠心肌缺血/再灌注對心肌組織內(nèi)感覺神經(jīng)肽 SP、CGRP表達(dá)的影響。在動物注射STZ10周后將DM組和C組又分別隨機(jī)分為缺血再灌注組(I/R組)和假手術(shù)組(Sham組)兩個亞組,采用結(jié)扎左冠狀動脈

4、前降支的方法制備心臟缺血再灌注模型。采用免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)對左室缺血心肌組織內(nèi)的SP和CGRP的表達(dá)進(jìn)行定位和定量研究，對血清內(nèi)的SP和CGRP的表達(dá)進(jìn)行定量研究。
　　(4)II型糖尿病感覺神經(jīng)病變大鼠心肌缺血/再灌注后去甲腎上腺素及β1-腎上腺素能受體在心肌表達(dá)的改變。實(shí)驗(yàn)分組同（2）和（3），應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）的方法分別對血清和左室缺血心肌組織內(nèi)的去甲腎上腺素（NE）進(jìn)行定量分析

5、，應(yīng)用Western Blot的方法測量β1受體的表達(dá)水平，觀察糖尿病對大鼠心肌組織內(nèi)交感神經(jīng)反應(yīng)活性的影響。
　　結(jié)果：
　　(1)糖尿病組經(jīng)過四周高糖高脂飼料喂養(yǎng)體重比正常對照組有增加的趨勢，并且出現(xiàn)胰島素含量增高（P<0.05）和胰島素敏感性降低(P<0.05)。注射 STZ后10周內(nèi)糖尿病動物體重較對照組顯著減輕（P<0.05）。糖尿病組空腹血糖較對照組顯著升高(P<0.01)。DM組的血清胰島素含量較對照組降低(P

6、<0.05)。DM組的血清甘油三酯含量較對照組雖然有增高的趨勢，但差別沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　(2)糖尿病組甩尾時間較對照組顯著延長(P<0.01)。DRG內(nèi)SP和CGRP陽性神經(jīng)元豐富，糖尿病大鼠的 SP和 CGRP陽性表達(dá)明顯減弱（P<0.05），糖尿病大鼠的CGRP表達(dá)陽性神經(jīng)細(xì)胞減少46％,小細(xì)胞減少70%，SP表達(dá)陽性神經(jīng)細(xì)胞減少62%，小細(xì)胞減少59%; SP和CGRP免疫反應(yīng)陽性物質(zhì)集中在脊髓背角淺層（Ⅰ、Ⅱ?qū)樱?正常

7、缺血再灌注組(C-I/R)與正常假手術(shù)組(C-SHAM)比較:DRG內(nèi) CGRP含量明顯上升(P=0.001)。糖尿病缺血再灌注組(D-I/R)與糖尿病假手術(shù)組(D-SHAM)比較:DRG內(nèi)CGRP含量明顯上升(P=0.001)。糖尿病假手術(shù)組(D-SHAM)與正常假手術(shù)組(C-SHAM)比較:DRG內(nèi) CGRP含量明顯下調(diào)(P=0.001)。糖尿病缺血再灌注組(D-I/R)與正常缺血再灌注組(C-I/R)比較:DRG內(nèi)CGRP和SP都

8、明顯下調(diào)(P<0.01)。
　　(3)心臟內(nèi) CGRP和 SP免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)纖維多見于心外膜和心肌層,尤其是圍繞血管周圍及血管內(nèi)皮有強(qiáng)陽性反應(yīng),糖尿病大鼠CGRP和SP免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)纖維明顯減少。正常缺血再灌注組(C-I/R)與正常假手術(shù)組(C-SHAM)比較:左室缺血心肌組織和血清內(nèi)CGRP和SP均明顯上調(diào)(P<0.05)。糖尿病缺血再灌注組(D-I/R)與糖尿病假手術(shù)組(D-SHAM)比較:左室缺血心肌組織和血清內(nèi)CGRP

9、明顯上調(diào)(P<0.05)。糖尿病假手術(shù)組(D-SHAM)與正常假手術(shù)組(C-SHAM)比較:左室缺血心肌組織和血清內(nèi)CGRP和SP均明顯下調(diào)(P<0.05)。糖尿病缺血再灌注組(D-I/R)與正常缺血再灌注組(C-I/R)比較:左室缺血心肌組織和血清內(nèi)CGRP和SP均明顯下調(diào)(P<0.05)。
　　(4)左心室缺血心肌組織NE含量：無論是DM組內(nèi)還是對照組內(nèi)Sham組均較I/R組有增高趨勢，但差別沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，DM組和對照組的含

10、量比較也沒有差別。血清NE含量：DM組和對照組的比較有一定的降低趨勢，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但各組內(nèi)I/R組均較Sham組有顯著增高（P<0.05）。Western Blot的方法測量β1受體的表達(dá)情況：C-SHAM比C-I/R的表達(dá)量增高（P<0.05）。D-SHAM比D-I/R也有增高趨勢，但差別沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。DM組和對照組比較，有降低趨勢，但差別沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　(1)單純應(yīng)用高糖高脂飼料喂養(yǎng)，糖尿病

11、組的大鼠體重顯著的增加，并且出現(xiàn)了一定程度的胰島素含量的增高和胰島素敏感性的降低；在此基礎(chǔ)上注射小劑量鏈脲佐菌素，誘發(fā)血糖顯著增高。飼養(yǎng)過程中，糖尿病組的大鼠出現(xiàn)了類似人類2型糖尿病三多一少的典型表現(xiàn)，并且有毛發(fā)凌亂和精神萎靡的病態(tài)特征。注射 STZ10周后， DM組的胰島素相對缺乏，甘油三酯有增高的趨勢。
　　(2)糖尿病誘發(fā)顯著感覺神經(jīng)功能退化；糖尿病動物在心肌缺/血再灌注中支配心臟的感覺神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)CGRP和SP顯著低于非糖尿