不同年齡女性人體脂肪來源干細胞體外培養(yǎng)生長特點比較.pdf

1、實驗目的：
　　 觀察26至45歲之間不同年齡段人體脂肪干細胞體外培養(yǎng)細胞的生長特點。于不同年齡人體腹部皮下取用等量脂肪組織，通過膠原酶消化法分離提取脂肪干細胞，計數(shù)原代單核細胞數(shù)，記錄細胞傳代時間，檢測細胞周期和細胞增殖活性。通過不同年齡段間ASCs細胞增殖能力的比較，明確不同年齡段間的細胞是否存在增殖能力的差異，為ASCs的臨床應用提供更多依據(jù)。
　　 實驗方法：
　　 1、樣本分組。24例患者分組:第一組:

2、26-30歲6例，(27.50±1.52歲);第二組:31-35歲6例，（32.50±1.38歲）;第三組:36-40歲6例，(37.83±1.47歲);第四組:41-45歲6例，(42.67±1.63歲)。
　　 2、脂肪干細胞體外分離、培養(yǎng)。臨床于此四組行脂肪抽吸手術(shù)的女性患者腹部皮下獲取約50-100ml脂肪組織，PBS浸泡轉(zhuǎn)入實驗室，無菌條件下強力清洗至少3次，剔除可見的血管和結(jié)締組織，離心后取10ml脂肪組織，Ⅰ型膠原

3、酶37℃條件下消化30min，加入等量含10％FBS的DMEM，1000rpm室溫離心5min，棄去上清液及脂肪組織，加入紅細胞裂解液，500rpm、4℃離心5min，棄去上清液，以含10％FBS的DMEM重懸沉淀細胞，接種于細胞培養(yǎng)皿。將培養(yǎng)皿置于37℃、體積分數(shù)5％CO2培養(yǎng)箱，24小時后觀察細胞貼壁狀態(tài)，并進行第一次換液，以后每周換液2次。待原代細胞長至80％融合，按1∶3傳代，每2-3天換一次液，傳至第3代細胞備用。
　　

4、 3、原代ASCs有核細胞計數(shù)。對從脂肪組織中分離提取的原代細胞進行有核細胞計數(shù)，于原代細胞培養(yǎng)至第10d計數(shù)收獲的有核細胞數(shù)，并記錄至原代細胞達80％融合時的各樣本所需時間。
　　 4、流式細胞儀測定ASCs細胞周期。選取生長至80％融合時的第3代ASCs細胞，消化并離心，以70％冰乙醇吹散后置入4℃條件下過夜固定，用預冷的PBS漂洗離心，以RNaseA37℃水浴處理30min,再加入PI染液4℃避光染色30min，上流式細

5、胞儀488nm檢測。
　　 5、MTT法測定ASCs細胞生長曲線。取不同年齡組的第3代ASCs，以5×103的細胞密度接種于96孔板中，按MTT法處理細胞，繪制細胞生長曲線。測定細胞倍增時間(TD)，根據(jù)公式TD=t(lg2/lgNt-lgN0)換算出細胞倍增時間。
　　 6、實驗所得數(shù)據(jù)用SPSS17.0軟件系統(tǒng)進行方差分析(P＜0.05)。
　　 實驗結(jié)果：
　　 四組間原代單核細胞計數(shù)(P＞0.05

6、)，而細胞生長至80％融合時所需時間第二組與第三組、第三組與第四組比較(P＜0.05);低年齡組細胞傳代時間相對較短，細胞生長較迅速，集落范圍較大，數(shù)目多，且處于增殖期的細胞比例較多，細胞活性較好，而第四組細胞生長較慢，集落形成較小，數(shù)量少，第三組細胞處于增殖期的比例明顯高于第四組(P＜0.05)，統(tǒng)計學差異顯著;細胞活性比較第二組與第三組之間無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，而第二、三組與第四組相比統(tǒng)計學差異顯著(P＜0.05)。