斑節(jié)對蝦C1qBP及MP1的cDNA克隆與表達(dá)分析.pdf

1、斑節(jié)對蝦(Penaeusmonodon)是我國海水養(yǎng)殖的重要經(jīng)濟品種。近年來，斑節(jié)對蝦親蝦養(yǎng)殖突破了不能人工調(diào)控成熟的瓶頸，獲得以生態(tài)調(diào)控和營養(yǎng)調(diào)控為基礎(chǔ)的全人工親蝦培育技術(shù)的巨大進展，但養(yǎng)殖過程中的病害威脅和蝦體抗病力差依然是造成斑節(jié)對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量偏低的重要原因。為此迫切需要從斑節(jié)對蝦免疫系統(tǒng)入手，發(fā)掘和分析免疫相關(guān)的基因，研究其免疫調(diào)控規(guī)律，探討其抗病機理，為進一步篩選抗病基因，從基因水平進行品種改良，提高蝦體抗病能力奠定基礎(chǔ)。

2、>　　 為了研究宿主與病原微生物的相互作用，在所獲得溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)感染斑節(jié)對蝦的前后的轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)數(shù)據(jù)庫中，經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫比對分析發(fā)現(xiàn)補體系統(tǒng)重要配體分子補體1q結(jié)合蛋白(complementcomponent1qsubcomponent-bindingprotein，C1qBP)和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinases，MAPKs)信號通路配體分子M

3、APK激酶1相互作用蛋白(MAPKkinase1interactingprotein1，MP1)兩個表達(dá)序列標(biāo)簽(ExpressionSequenceTag，EST)。
　　 C1qBP是一個能結(jié)合多種配基、分布廣泛的多功能蛋白，調(diào)控機體對炎癥和微生物感染的免疫反應(yīng)。利用RACE技術(shù)獲得斑節(jié)對蝦C1q結(jié)合蛋白(以下簡稱PmC1qBP)全長cDNA為1303bp，包括789bp的開放閱讀框(ORF)，104bp的5’UTR和410

4、bp的3’UTR(GenBankID：HQ412588)。預(yù)測PmC1qBP蛋白編碼262個氨基酸，分子量大小為29.07KDa，理論等電點為4.74，生物信息學(xué)分析表明，PmC1qBP氨基酸序列含有2個潛在的糖基化位點Asn31和Asn127。其中78aa-259aa是一個保守的MAM33superfamily結(jié)構(gòu)域，是與C1q的球狀頭部結(jié)合的部位，69aa-71aa為一個RGD序列，是細(xì)胞粘合素結(jié)合的位點。利用MatGAT軟件進行同

5、源性和相似性分析，結(jié)果表明PmC1qBP與其它物種C1qBP序列具一定程度的保守性，同源性為(25.2％-71.9％)，相似性為(46.6％-82.4％)。進化樹分析表明，PmC1qBP與淡水螯蝦聚為一支，與埃及伊蚊等無脊椎動物有比較近的親源關(guān)系。利用半定量和實時定量PCR(Real-timePCR)進行組織表達(dá)模式分析，結(jié)果表明PmC1qBmRNA在淋巴、肝胰腺、腸、血細(xì)胞、鰓、性腺、胃、神經(jīng)中都有表達(dá)，并且在雌雄斑節(jié)對蝦中的腸、胃、

6、性腺、血細(xì)胞中的表達(dá)量分別存在著顯著差異。PmC1qBP基因在不同發(fā)育階段的表達(dá)特征結(jié)果表明，PmC1qBP基因在幼體時表達(dá)量低，隨著發(fā)育階段的推進，表達(dá)量逐漸上升，最后趨于穩(wěn)定。利用實時定量PCR(Real-timePCR)檢測了斑節(jié)對蝦肝胰腺組織對脂多糖(LPS)、肽聚糖(PGN)和溶藻弧菌免疫應(yīng)激表達(dá)譜，結(jié)果顯示LPS和溶藻弧菌顯著誘導(dǎo)PmC1qBP轉(zhuǎn)錄本表達(dá)上調(diào)，而PGN誘導(dǎo)效果不明顯，溶藻弧菌刺激后3h后表達(dá)略有降低，當(dāng)達(dá)到6

7、h后，表達(dá)量達(dá)到最大值，刺激組和對照組有極顯著差異，這與轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)結(jié)果一致，這些結(jié)果說明PmC1qBP可能參與了斑節(jié)對蝦抗菌的天然免疫應(yīng)答反應(yīng)。將該基因克隆到原核表達(dá)載體pET32a中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌并成功誘導(dǎo)表達(dá)帶His-tag的融合蛋白，進一步用Ni-NTA親和層析柱將重組蛋白純化，獲得了高含量高純度的目的蛋白，并免疫小鼠制備多克隆抗體。利用PmC1qBP多抗，確定了天然PmC1qBP是一種不溶性蛋白，并在肝胰腺、精巢、腸中均有表

8、達(dá)，存在38kD的前體和29kD的成熟肽兩種形式。利用純化后的融合蛋白進行C1q競爭性抑制實驗，發(fā)現(xiàn)rC1qBP能競爭性結(jié)合鼠C1q，證實了其結(jié)合活性。
　　 MP1可結(jié)合MAPK/ERK激酶，調(diào)控、分化、遷移、細(xì)胞增殖和炎癥反應(yīng)，同時研究發(fā)現(xiàn)MP1參與小鼠早期胚胎和皮膚發(fā)育過程。斑節(jié)對蝦的MP1(以下簡稱PmMP1)基因為910bp，包含372bp的ORF，29bp的5’UTR和509bp的3’UTR(GenBankID：HQ

9、339913)。預(yù)測MP1蛋白包含123個氨基酸，分子量大小為13.6KDa，理論等電點為6.3，BLAST同源性分析顯示，MP1的氨基酸序列包含一個保守的MAPKK1-int結(jié)構(gòu)域(12aa-108aa)。同源性分析表明PmMP1蛋白與其他物種該蛋白具有較高的保守性，其中與麗蠅蛹集金小蜂(Nasoniavitripennis)和海膽(Strongylocentrotuspurpuratus)、同源性分別為48％和47.5％。進化樹結(jié)果