幾種紅樹植物的遺傳變異和抗鹽特性的分子生態(tài)學研究.pdf

1、幾種紅樹植物的遺傳變異和抗鹽特性的分子生態(tài)學研究周涵韜(廈門大學生命科學學院，廈門361005)中文摘耍紅樹林(Mangroves)是生長于熱帶、亞熱帶陸海交匯的海灣河口潮間帶的鹽生木本植物群落，它組藏著豐富的動植物、徽生物墓因庫，是一種珍貴的生物資源。紅樹林在維護海岸生態(tài)平街:防風減災、護堤保岸環(huán)境污染監(jiān)側、凈化與防治等上發(fā)揮重要的作用。目前國內(nèi)外對紅樹植物開展了大盆的生物學研究工作，成果多集中在生態(tài)學，生理學，生物化學等領域，而分子

2、生物學領域的研究工作還處于起步階段。本文運用RAPD分子標記技術，對不同種屬紅樹植物的遺傳變異與生態(tài)分化進行了研究首次運用改進的mRNA差別顯示技術，從抗鹽能力強的泌鹽紅樹植物一白骨坡基因組中分離克隆了抗鹽相關荃因。同時運用蛋白質雙向電脈球術，從白骨坡葉片中分離了抗鹽相關蛋白質，并初步分析了該蛋白質的生化特性。1具體結果如下:1.采用改良的CTAB抽提方法，成功地從不同種屬紅樹植物的葉片中提取和純化了基因組DNA。獲得的DNA純度較好認

3、二。A28。在1.61.8之間)，得率高(平均得率約為1201gDNAgF.W.)，片段完整(片段大小約為23Kb左右).適宜于進行PCR擴增及后續(xù)分子生物學研究.說明本文首次在前人工作基礎上加以改進的CTAB法，廣泛適用于富含單寧、多糖、脂類、膠質類物質等的紅樹植物基因組DNA的提取與純化。RAPD擴增反應的穩(wěn)定性、重復性及擴增帶型的豐富性是進行紅樹植物遺傳多樣性分析的基礎。使用德國Biometra公司T3型PCR儀，規(guī)范實臉操作，采

4、用如下反應體系:10mmolLTrisHC1PH8.050mmolLKCI0.01%明膠，80ng模板DNA2mmolLMgC120.2mmolLdNTPs0.21molL10核普酸隨機引物，0.5UTaqDNA聚合醉，總休積251L。擴增程序為:94C變性lmin36C退火lmin720C延伸2min，共進行4。個循環(huán)，最后72C延伸7min。獲得的RAPD擴增結果穩(wěn)定性高，重復性好，擴增帶型豐富平均為67條。2.以福建九龍江口龍海紅

5、樹林自然保護區(qū)浮宮種苗園內(nèi)白骨坡(Avicenniamarina)桐花樹(Aegicerascorniculatui)、無瓣海桑(Sonneratiaapetala)、秋茄(Kandeliacandel)、木祖(Bruguieragyanorrhiza)、海蓮(BruguieraSexangula)、尖瓣海蓮(Bruguierasexangulavar.rhynchopetala)等7種紅樹植物為材料，運用RAPD技術對這7種紅樹植物進

6、行了遺傳多樣性分析。從30個10核普酸隨機引物中篩選出15個有效引物。利用這15個有效引物共擴增出630條DNA帶，其中多態(tài)性條帶535，占總擴增條帶的84.92%.利用Nei指數(shù)法得出7種紅樹植物間58.01%。Nei指數(shù)法分析和UPGMA統(tǒng)計分析表明，6種海桑屬紅樹植物分為ABC三個組，平均遺傳距離為0.38A組包括無瓣海桑、海南海桑、卵葉海桑、杯粵海桑。其中無瓣海桑、海南海桑、卵葉海桑處于同一個組。B組包括擬海桑。C組包括海桑。目

7、前無瓣海桑己引種到福建九龍江口，對海南和福建無瓣海桑種群進行RAPD分析。Shannons表型多樣性指數(shù)統(tǒng)計結果表明，福建種群為。669，海南種群為0.671.各種群遺傳變異較大，這與無瓣海桑種群廣泛的適應性相一致。種群間的Shannons表型多樣性指數(shù)分析表明，種群內(nèi)的遺傳變異占整個遺傳變異的93.3，而亞種群間的遺傳變異僅占6.7%?？梢?，無瓣海桑種群的大部分遺傳變異存在于種群內(nèi)，而亞種群間的遺傳變異較小。由此可見，無瓣海桑基因組豐

8、富的多樣性，是使其由海南成功引種到福建的重要因素。本文同時探討了與無瓣海桑遺傳距離較近的海南海桑(0.32)和卵葉海桑(0.26)，作為海桑屬紅樹植物進一步由海南向福建引種的可能性。5.建立起適合于紅樹植物簡便、快速的.RNA差別顯示系統(tǒng)。在福建九龍江口龍海紅樹林自然保護區(qū)浮宮種苗園采集白骨坡的隱胎生種子，在實驗室分別置于00.60鹽度海水(自來水)和50編鹽度海水進行沙培。分別取葉片，提取純化RNA。利用所建立的。RNA差別顯示系統(tǒng)，

9、通過8個10核昔酸隨機引物PCR擴增，篩選抗鹽相關基因。8%非變性聚丙烯酸膠凝膠電泳后，經(jīng)比較高鹽(50%u鹽度海水沙培)和無鹽(0%鹽度海水沙培)條件下白骨坡mRNA差別顯示的電泳圖譜，發(fā)現(xiàn)了3個差異DNA片段。這3個片段只在高鹽培養(yǎng)條件的白骨鑲基因組中表達，而在低鹽培養(yǎng)條件中沒有出現(xiàn)。這些差異DNA片段可能就是抗鹽相關荃因，分別命名為csrgl(6006p)csrg2(550bp)、csrg3(480bp)回收3個差異DNA片段，再

10、次用相應的引物進行PCR擴增，并用6核普酸隨機引物和同位素標記該差異DNA片段，然后分別與高鹽條件培養(yǎng)和無鹽條件培養(yǎng)下白骨坡葉片的RNA進行雜交。結果顯示，只有csrgl在高鹽和無鹽條件下有明顯差異(高鹽中有雜交斑點，無鹽中無雜交斑點)其余2個片段在高鹽和無鹽條件下都沒有雜交斑點出現(xiàn)。從而表明csrgl就是抗鹽相關基因。進一步將csrgl片段克隆，并進行DNA序列分析。結果表明，csrgl片段全長為5936p，并獲得其酶切物理圖譜。全序

11、列在基因Bank中查詢后，未發(fā)現(xiàn)相關同源基因?？果}相關DNA片段的獲得，將為分離全長抗鹽基因，搞清該荃因表達調(diào)控的機理提供條件。6.在進行白骨坡抗鹽相關基因篩選的同時，運用蛋白質雙向電泳技術試圖分離抗鹽相關的蛋白質。分別從高鹽條件培養(yǎng)(50060鹽度海水)和無鹽條件培養(yǎng)(0%鹽度海水)下白骨坡葉片中抽提總蛋白質。利用美國BioRad公司雙向電泳系統(tǒng)，在相同的條件下同時進行雙向電泳。第一向為等電聚焦電泳(pH310)，第二向為SDSPAG