基于遺傳改造發(fā)掘深海鏈霉Streptomyces somaliensis SCSIO ZH66的次級(jí)代謝產(chǎn)物.pdf

1、深海鏈霉菌Streptomyces somaliensis SCSIO ZH66分離自我國(guó)南海深度為3536米的海底沉積物之中。深海鏈霉菌的所處環(huán)境十分特殊（如:高鹽、高壓、低溫、低光照、低氧和寡營(yíng)養(yǎng)），在這種極端環(huán)境下它們進(jìn)化形成了獨(dú)特的次級(jí)代謝途徑，從而產(chǎn)生結(jié)構(gòu)類型新穎多樣并具有優(yōu)良活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物。S.somaliensis SCSIO ZH66的全基因組測(cè)序及生物信息學(xué)分析結(jié)果表明:其基因組大小約為7.1 Mb，由124個(gè)連續(xù)

2、克隆群組成，推測(cè)共包含6312個(gè)開放閱讀框，預(yù)測(cè)有16個(gè)編碼次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成基因簇。本研究采用基因阻斷、基因調(diào)控及異源表達(dá)等策略對(duì)深海鏈霉菌S.somaliensis SCSIO ZH66進(jìn)行了基因組采掘研究。主要獲得了以下結(jié)果:
　　第一，對(duì)新穎的非核糖體肽合成酶（nonribosomal peptide synthetase，NRPS）生物合成基因簇nrps-3進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，預(yù)測(cè)其可能編碼一類糖基化或甲基化的結(jié)構(gòu)

3、新穎的天然產(chǎn)物;對(duì)其中非核糖體肽合酶基因orf7和orf8進(jìn)一步分析，推測(cè)編碼產(chǎn)物由6個(gè)氨基酸前體形成?；螂p交換阻斷突變株△orf8發(fā)酵產(chǎn)物的HPLC指紋圖譜分析結(jié)果表明，其次級(jí)代謝產(chǎn)物相比于野生型菌株有明顯的差異。隨后對(duì)突變株△orf8進(jìn)行了大規(guī)模發(fā)酵，樣品經(jīng)過C18反相開放柱得到了15個(gè)組分。多重耐藥菌(multi-drug resistant，MDR)抑制活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明突變株與野生株所產(chǎn)生的差異峰所在組分Fr.6具有明顯的MR

4、SA(methicillinresistant Staphylococcus aureus)抑制活性。進(jìn)而對(duì)Fr.6中的差異峰進(jìn)行了分離純化得到了5個(gè)化合物，并通過HRMS和NMR分析確定了它們的結(jié)構(gòu)，分別為violapyrones A-C、H和I。其中violapyrone B的MRSA抑制活性為:100μg樣品對(duì)MRSA的抑菌圈直徑為25 mm。此研究結(jié)果表明，nrps-3基因簇中orf8基因的阻斷未檢測(cè)到nrps-3基因簇的編碼產(chǎn)

5、物，但使突變株積累了violapyrones類化合物。
　　第二，多效調(diào)控基因regP12在S.somaliensis SCSIO ZH66中的異源表達(dá)研究。將來源于另外一株海洋鏈霉菌Streptomyces sp.OUC6819的多效調(diào)控基因regP12置于組成型表達(dá)啟動(dòng)子gapDHp之下構(gòu)建成表達(dá)載體，然后采用接合轉(zhuǎn)移方法導(dǎo)入S.somaliensis SCSIO ZH66之中，獲得重組菌株ZH66/pMT3∷regP12。重