葉柄缺乏對(duì)子宮內(nèi)膜受性相關(guān)基因表達(dá)的甲基化調(diào)控及其對(duì)胚胎著床的影響.pdf

1、第一部分:葉酸缺乏對(duì)子宮內(nèi)膜容受性相關(guān)基因表達(dá)的甲基化調(diào)控及其對(duì)胚胎著床的影響
　　目的：葉酸是哺乳類(lèi)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中擔(dān)負(fù)一碳單位傳遞的B族維生素，是機(jī)體各種甲基化反應(yīng)的甲基供體。葉酸攝入不足或葉酸代謝障礙時(shí)，可引起基因組DNA固有甲基化模式的改變而促進(jìn)基因表達(dá)或抑制基因表達(dá)，誘發(fā)疾病狀態(tài)，通過(guò)表觀遺傳修飾這一途徑參與多種生命活動(dòng)過(guò)程中的基因表達(dá)調(diào)控。但迄今為止，對(duì)于在妊娠早期子宮內(nèi)膜容受性建立過(guò)程中，低葉酸水平是否會(huì)通過(guò)表觀遺

2、傳修飾(DNA甲基化)來(lái)調(diào)控子宮內(nèi)膜容受性相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而影響胚胎著床，目前未見(jiàn)任何相關(guān)報(bào)道。因此，本研究旨在探索孕期低葉酸水平是否會(huì)影響子宮內(nèi)膜容受性相關(guān)基因(Cdh1、Pgr、Esrl)DNA甲基化模式及其基因表達(dá)的改變，從而對(duì)胚胎著床產(chǎn)生影響。
　　方法：建立葉酸缺乏孕鼠和正常孕鼠胚胎著床模型。采用甲基化特異性PCR和亞硫酸氫鈉測(cè)序方法對(duì)Cdhl、Pgr、Esrl基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化模式進(jìn)行分析。采用Real-time

3、PCR、Western-blot、免疫組化對(duì)Cdhl、Pgr、Esrl基因的mRNA和蛋白表達(dá)進(jìn)行分析。采用掃描電鏡方法對(duì)子宮內(nèi)膜容受性建立的形態(tài)學(xué)標(biāo)志物-胞飲突的形態(tài)和數(shù)量進(jìn)行檢測(cè)。孕鼠尾靜脈注射臺(tái)盼藍(lán)后計(jì)數(shù)孕鼠妊娠第5天的胚胎著床點(diǎn)數(shù)量。
　　結(jié)果：甲基化分析結(jié)果顯示葉酸缺乏情況下Esrl基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化率顯著降低，而Cdhl、Pgr基因啟動(dòng)子的甲基化率沒(méi)有發(fā)生顯著改變?；虮磉_(dá)分析結(jié)果顯示葉酸缺乏孕鼠組Esrl基因表達(dá)顯

4、著降低，而Cdhl、Pgr基因表達(dá)略高于正常對(duì)照組，但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。掃描電鏡結(jié)果顯示葉酸缺乏情況下胞飲突的數(shù)量和形態(tài)均未發(fā)生明顯改變。與正常對(duì)照組相比較，葉酸缺乏孕鼠組的妊娠率和妊娠第5天孕鼠的胚胎著床點(diǎn)數(shù)量均沒(méi)有發(fā)生顯著改變，胚胎正常著床。
　　結(jié)論：在子宮內(nèi)膜容受性建立這一正常生理過(guò)程中，DNA甲基化對(duì)容受性相關(guān)基因Cdhl、Pgr的表達(dá)調(diào)控作用并不明顯，而Esrl的表達(dá)可能會(huì)受到DNA甲基化調(diào)控，但并不影響胚胎正常著床。

5、葉酸缺乏下胚胎能夠正常著床提示葉酸缺乏導(dǎo)致胚胎發(fā)育異常可能是著床以后的胚胎發(fā)育發(fā)生了異常。甲基化調(diào)控在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中與子宮內(nèi)膜容受性建立這一正常生理過(guò)程中的不同作用，可能會(huì)為闡明腫瘤侵襲的“無(wú)控性”和胚胎著床的“有控性”機(jī)制提供新的線索。
　　第二部分:葉酸缺乏對(duì)著床后子宮內(nèi)膜蛻膜化的影響
　　目的：胚胎著床以后子宮內(nèi)膜蛻膜功能的正常表達(dá)是胎盤(pán)形成的重要基礎(chǔ)，并在胎盤(pán)形成以前擔(dān)負(fù)著保護(hù)和營(yíng)養(yǎng)胚胎的重要作用，對(duì)妊娠的建立和

6、維持至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)葉酸對(duì)胎盤(pán)的發(fā)育起著重要作用。但葉酸對(duì)著床后子宮內(nèi)膜蛻膜化進(jìn)程的影響以及葉酸缺乏是否會(huì)引起子宮內(nèi)膜蛻膜化發(fā)生改變，從而造成胚胎發(fā)育異常，目前并不清楚，這值得我們?nèi)ヌ剿?。因此，本研究旨在探索著床后子宮內(nèi)膜蛻膜化是否會(huì)受到孕期低葉酸水平的影響。
　　方法：建立葉酸缺乏孕鼠和正常孕鼠胚胎著床模型，對(duì)孕鼠胎兒的出生情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。采用HE方法檢測(cè)孕鼠妊娠d7子宮內(nèi)膜形態(tài)。采用Real-time PCR、Western-

7、blot、免疫組化對(duì)孕鼠妊娠d7、d8子宮內(nèi)膜Hoxa10、MMP2基因表達(dá)進(jìn)行分析。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)妊娠d7子宮內(nèi)膜的凋亡情況，并采用Western-blot對(duì)凋亡相關(guān)因子Bax、Bcl2的表達(dá)進(jìn)行了分析。
　　結(jié)果：葉酸缺乏孕鼠組胎兒出生率為(0，0/20)顯著低于正常對(duì)照組(90％，18/20)。觀察妊娠d7孕鼠子宮，葉酸缺乏孕鼠組(50％，4/8)胚胎呈現(xiàn)不同程度的吸收和發(fā)育阻滯現(xiàn)象，明顯高于正常對(duì)照組(12.5％，1/

8、8)。HE染色觀察發(fā)現(xiàn)妊娠d7葉酸缺乏孕鼠組子宮內(nèi)膜蛻膜形態(tài)發(fā)生改變。進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)葉酸缺乏情況下，在蛻膜化過(guò)程中起著重要作用的Hoxa10和MMP2基因表達(dá)顯著降低。凋亡的正常維持對(duì)蛻膜化具有重要意義。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)葉酸缺乏孕鼠組妊娠d7子宮內(nèi)膜的凋亡率明顯低于正常對(duì)照組，且葉酸缺乏孕鼠組促凋亡因子Bax蛋白表達(dá)明顯低于正常組，而抑凋亡因子Bcl2的表達(dá)卻顯著高于正常組。
　　結(jié)論：研究發(fā)現(xiàn)葉酸缺乏情況下，在子宮內(nèi)膜的蛻膜化中起著重要